CD20 Pacific Orange™
变更原因：经常缺货。
变更后的试剂：CD20 Spark Violet™ 538 (Biolegend Cat. 302373)。
变更后的表现：成功替换了原始试剂，保留了方案的性能。
CD25 PE-Alexa Fluor™ 700
变更原因：经常缺货。
变更后的试剂：CD25 cFluor® BYG710 (Cytek Biosciences Cat. R7-20660)。
变更后的表现：提供了与原始试剂相似的分辨率和模式。
CD24 PE-Alexa Fluor™ 610
变更原因：经常缺货。
变更后的试剂：CD24 cFluor® YG610 ( Cytek Biosciences Cat. R7-20658 )。
变更后的表现：提供了与原始试剂相似的分辨率，减少了对蓝激光激发的荧光染料的扩散。
CD127 APC-R700
变更原因：经常缺货。
变更后的试剂：CD127 cFluor® R720 (Cytek Biosciences Cat. R7-20664 )。
变更后的表现：提供了与原始试剂相似的分辨率。
HLA-DR PE/Fire™ 810
变更原因：技术问题，光照下可能易发生串联降解。
变更后的试剂：HLA-DR BV480 (BD Biosciences Cat. 752499)。
变更后的表现：提供了稳定的性能，减少了数据中的错误。
TCRγδ PerCP-eFluor® 710
变更原因：技术问题，由于意外的光谱特征。
变更后的试剂：TCRγδ PerCP-Vio® 700 (Miltenyi Cat. 130–113-514)。
变更后的表现：尽管染色模式有所变化，但阳性事件的频率保持不变。
IgD BV480
变更原因：需要更好的性能。
变更后的试剂：IgD cFluor® BYG750 (Cytek Biosciences Cat. R7-20662)。
变更后的表现：提供了与原始试剂相似的分辨率，增加了亮度。
CD57 FITC
变更原因：FITC 和 BB515之间的相似性指数高（0.98），导致数据中的高扩散。
变更后的试剂：CD57 cFluor B532(Cytek Biosciences Cat. R7-20656)。
变更后的表现：显著降低了与BB515之间的相似性指数和溢出扩散值，改善了数据质量。
图1. 试剂稳定性、特异性和可用性面临挑战：（A）PE/Fire 810试剂在光照下稳定性差，导致解混错误；（B）TCRγδ PerCP-eFluor 710染色人全血出现意外的光谱特征；（C）TCRγδ分辨率低，调整染色条件未能改善；（D）FITC与BB515高度相似，导致多个通道数据扩散高，移除FITC可减少扩散。
图2. 变更前后比较：通过外周血单个核细胞上的染色指数比较了染色模式和分辨率，具有相似的阳性细胞百分比。
图3. 变更试剂的性能评估：包括不同染料标记CD57的滴定比较，以及CD57 cFluor B532在多色方案中不同CD8 T细胞亚群上的表现。同时，对CD24的抗体性能进行了滴定。结果显示，变更后试剂能有效识别目标细胞群体。
图5. 在多色染色中，变更后的荧光染料提高了细胞群体的分辨率，这得益于荧光染料亮度的提升（CD57 cFluor B532、CD20 Spark Violet 538、IgD cFluor BYG750、HLA-DR BV480、CD25 cFluor BYG710和CD127 cFluor R720）和/或背景的减少（CD57 cFluor B532、TCR γδ PerCP-Vio700、IgD BYG750、CD24 cFluor YG610、CD127 cFluor R720）。
变更试剂以粗体突出显示，试剂按字母数字顺序排列。
图4. 方案变更前后表现：在执行UMAP分析后，运行FlowSOM对数据进行聚类。变更后，所有细胞亚群的分辨率得以保留，并且在某些情况下有所提高。
在无法判断表现情况时，同克隆的PE试剂表现是个很好的参考标准(如CD57 cFluor B532和CD57 FITC在CD8+T各亚群上的Pattern不一致时)。
人全血样本使用TCRγδ PerCP-eFluor 710染色后出现异常光谱特征，不同于自发荧光，导致细胞群体分辨率降低。尽管采取了多种措施，包括滴定和添加阻断剂，问题仍不能得到改善。
TCRγδ不同克隆（B1.1与REA591，均为所有循环TCRγδ的泛标志物）染色模式有所变化（使用B1.1克隆时观察到三个对角线群，而使用REA591克隆时仅观察到一个单一对角线群），但阳性事件的频率保持不变，推测这两个克隆结合到不同的构象表位，导致染色轮廓的差异。通过CD3+ TCRγδ+群体内TIGIT、CD38、CD27和CD45RA的表达，证实了两个克隆均能有效识别delta变体Vd1和Vd2。
流式通
