张立明博士谈磁性荧光编码微球自主创新

文摘   科学   2024-09-27 23:59   上海  

【微球流式】
包括所有利用微球——不管是否有磁性,去捕捉溶液中的待测分子,利用流式原理进行检测——微球流动起来,目前看一定是荧光的技术。
TA有很多别的名称,如:流式荧光、液相芯片、悬浮阵列、多功能流式点阵、多重微珠流式免疫荧光、流式点阵免疫发光、流式荧光发光、免疫荧光发光等。

微球流式作为一种高效的检测手段,已经在蛋白和分子多参数检测领域发挥着越来越重要的作用。该方法以其高通量、高灵敏度和高特异性,为科研和临床诊断提供了强有力的技术支持。
磁性荧光编码作为微球流式的核心原料,无疑是这一先进技术能够广泛应用的关键环节。



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表面基团

羧基微球偶联在微球流式检测领域中最为常用,该技术主要通过微球表面的羧基(-COOH)与蛋白质的氨基(-NH2)之间的共价连接来实现。
然而,这一化学偶联过程并非简单易行,它受到多种因素的复杂影响。反应条件的细微变化、微球和蛋白质本身的性质等,都可能对偶联效果产生显著影响。
  • 微球表面特性:羧基化微球的表面特性直接影响偶联效率。

  • 羧基密度:羧基密度越高,蛋白质附着的位点就越多,偶联效率越高。但过度的拥挤会导致空间位阻。

  • 表面电荷:微球的离子电荷会影响蛋白质的吸附。正负电荷之间的平衡可以增强静电引力,提高偶联效率。

  • 非特异性吸附:普通的羧基磁性荧光编码微球(本质是聚苯乙烯磁球)对蛋白质存在一定的非特异性吸附,在某些项目中导致背景值/噪音值显著增高,从而影响最终的检测结果。

  • 蛋白质的性质:被偶联的蛋白质的特性在确定偶联效率方面也起着重要作用。

  • 分子量:较大的蛋白质可能会在空间上阻碍其他蛋白质或分子的附着,从而降低整体偶联效率。相反,较小的蛋白质由于空间阻碍较小,可能更容易偶联。

  • 等电点(pI):蛋白质的pI会影响其在给定缓冲液中的电荷。当溶液的pH值低于蛋白质的pI时,通常会发生有效偶联,导致净正电荷,增强对带负电荷微球的静电吸引。当遇到某些蛋白等电点特别低时,偶联效率往往是不理想的。

  • 蛋白构象:蛋白质的构象状态(天然与变性)显著影响其与微球结合的能力。变性蛋白质可能会暴露出更多的反应位点,但也可能失去功能。

  • 实验条件:偶联效率对偶联过程中使用的反应条件高度敏感。

  • pH:缓冲液的pH值会影响微球的电荷和蛋白质。最佳pH水平应促进两者之间的最大相互作用。通常,低于蛋白质pI的pH值会因正电荷增加而增强结合。

  • 离子强度:缓冲液的离子强度可以屏蔽静电相互作用,影响蛋白质吸附。较低的离子强度可以通过促进静电吸引来增强偶联,而较高的离子强度会导致相互作用减弱。

  • 温度:较高的温度可以增加分子运动并提高耦合效率。然而,过高的温度可能会使敏感的蛋白质变性,导致功能丧失。

  • 反应时间:延长偶联时间可以提高效率,使更多的蛋白质与微球相互作用。然而,延长孵育时间也可能导致不希望的交联或聚集。

  • 蛋白质浓度:较高浓度的蛋白质可以增加与微球表面相互作用的可能性,从而提高偶联效率。优化蛋白质浓度对于防止饱和和确保有效结合至关重要。

其中最重要的因素之一就是(PI),当遇到某些蛋白等电点特别低时,偶联效率往往是不理想的。如果遇到非常不好连的蛋白时,可以考虑用碧芯生物特有的吡啶二硫基微球或者表面SA修饰的微球来替代。

新型高分子修饰羧基微球

我们自主研发了一种新型的对抗体/抗原非特异性吸附低的高分子材料BS10K,将其包裹在聚苯乙烯微球的表面,并衍生出各种各样的活性官能团。

由于低吸附羧基磁性荧光编码微球被高分子材料BS10K包裹,从而阻断了疏水的聚苯乙烯表面与环境中的抗原/抗体接触,可有效的降低检测中的噪音信号。

同时,由于这层高分子材料的表层,可以衍生出更多的功能基团,有利于提高信号,增强检测的灵敏度。

吡啶二硫基微球


以羧基微球为基础,通过表面聚乙二醇修饰,衍生出二硫键,然后偶联抗体。

具有以下优点:

  • 低吸附,噪音值低
  • 偶联工艺稳定
  • 信号值更高


2

热稳定性

微球能否耐受高温是分子检测的必要条件。这决定了编码微球能不能耐受杂交温度,直接在球上进行扩增。
通过工艺优化,我们的磁性荧光编码微球能耐受95度高温。
如下图所示:经历PCR热循环,磁性荧光编码微球的编码基本没有改变。这种耐受高温的优良性可为分子检测提供了更为可靠和稳定的工具。
反应条件:95°C 5分钟。加热前后微球都在Luminex200设定的同一个圈内,微球的分群荧光值基本保存不变。 

加热前 

加热后

3

适用仪器

微球流式荧光技术主要包含两大主流体系:
  • L体系:使用658/712 nm的分群滤片;
  • 传统流式平台体系:使用675/780 nm的滤片。

目前,这两种体系的仪器都已实现国产化。
我们推出的磁性荧光编码微球产品包括:
  • L体系的微球
如下图,最多可提供50重

  • 传统流式平台体系的微球
如下图36重,最多可提供50重

  • 兼容两大检测体系的微

目前可提供15重


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位置可控性

仪器的自动化分析通常需要给微球进行固定“圈门”.
通过为荧光编码微球设定固定的“圈门”来实现对检测位置的精确定位,这一过程对磁性荧光编码微球的批次间变异系数(CV值)控制提出了极高的要求。
我们能够将磁性荧光编码微球的编码位置变化控制在很小的范围内。这种精确的控制能力有助于减少不同批次微球之间的CV变化,提高分析结果的稳定性和可靠性,实现仪器的自动化分析。



碧芯生物是一家专注于流式荧光检测领域磁性荧光编码的高科技企业。公司由在生物、材料、医学等多学科领域有着扎实研究基础和丰富实践经验的博士团队组成。碧芯生物不仅提供丰富的磁性荧光编码微球产品,也提供基于流式荧光平台的研发服务。
相关产品见(https://beadstar.cn/
产品咨询(微信:18189751352)


陈在不在
作者自媒体 @ 生命科学与大健康产业 —— 聚焦原创,相信正向,眼中有光,一路向阳
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