聚前沿文献之声，解泌尿学术之惑
聚前沿文献之声，解泌尿学术之惑，这里是聚焦前列腺癌的《菲长视野 · 前献解泌》专栏。
本期与我们用声音见面的是中山大学附属肿瘤医院陈东教授，他将与大家一同分享一项近日发表于《Cancer Discovery》杂志（影响因子：29.7）的一项阐述前列腺癌中谱系特异性转录因子利用转座元件（transposable element，TE）作为致癌调控元件的研究。
在正常发育过程中，多能干细胞逐渐失去可塑性，进入多种成熟细胞状态。这种有关细胞命运的决定是由染色质变体确保的，这些变体对应于在细胞分化过程中改变染色质状态的基因组片段。染色质变体识别不同种类的脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）元件，有助于鉴别细胞身份。在多能干细胞中，非重复DNA中调控元件的染色质变异揭示了多能转录因子的结合位点（如NANOG、OCT4[POU5F1]和SOX2），而体细胞状态的染色质变异与谱系特异性转录因子相关。总体而言，寻找和表征跨细胞状态的染色质变异揭示了影响细胞命运决定的调控过程。
此外，肿瘤的发生也受染色质变异的调控。例如，前列腺癌表征的染色质变异揭示了作为促癌转录因子（包括雄激素受体[androgen receptor，AR]）、FOXA1和HOXB13）结合位点的调控元件。这些染色质变异富含前列腺癌的突变和风险变异。重复DNA中也报道了染色质变异，揭示了TE作为“调控性TE”的共同选择，促进癌基因过度表达。虽然后者与正常发育中TE的染色质相互作用功能的启动子、增强子或锚定一致，但此类调控性TE是否依赖于与非重复DNA序列共享/不共享的转录机制尚不清楚[1]。
研究对32种正常细胞状态的H3K27ac染色质免疫沉淀测序（chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq）数据的重复DNA序列进行定位分析，鉴定并表征了在正常细胞和前列腺癌细胞状态中作为调控性TE的重复DNA，报告了与多能干细胞相比，AR和FOXA1在前列腺上皮中活跃的TE中的作用。
从多能干细胞到成熟细胞和组织状态具有不同的调控性TE
为了系统评估多能干细胞和体细胞组织状态中调控性TE家族的富集程度，研究分析了来自32种不同细胞和组织状态的339例个体样本的ChIP-seq数据。研究发现，多能干细胞H3K27ac染色质变异中富集的TE家族数量更多（图1A），在成熟细胞和组织状态中发现的调控性TE家族并不局限于单个的超家族（图1C）。例如，肾上腺的染色质变异富集了ERV1超家族中MER65A家族的TE（q=5.86e-07，图1D）；角质细胞的染色质变异富集了LINE1超家族中L1MC3家族的TE（q=0.006，图1D）；SINE1超家族中AluSq4家族的TE优先出现在中性粒细胞的染色质变异中（q=0.004，图1D）；但多能干细胞中的23个调控性TE家族如LTR7 TE家族（q≤0.0085，图1D）仅属于ERV1超家族（图1C）。研究发现了多能干细胞中与成熟细胞和组织状态不同的调控性TE家族，其中多能干细胞特异性倾向于ERV1超家族的TE。
图1 TE家族在多能干细胞和体细胞组织活性调控元件中的作用
成熟细胞状态由谱系特异性转录因子的调控性TE定义
接下来研究者评估了调控性TE是否可以作为转录因子的结合位点，利用1185个转录因子的逆转座元件微卫星扩增多态性（retrotransposon-microsatellite amplified polymorphism，ReMap）图谱，测量了转录因子与多能干细胞状态的调控性TE家族结合的倾向。研究发现CHD7、NANOG、SOX2、OCT4（POU5F1）、TEAD4、GATA6和TRIM28是多能干细胞中最容易结合调控性TE家族的转录因子（前5%，图2D）。良性前列腺中排名前5%的转录因子包括CTCF、AR、XBP1、FOXA1、RELA、GRHL3和HIF1A（图2E）。
良性前列腺调控性TE家族中，AR和FOXA1特异性富集在L1PA6和LTR5B家族（L1PA6家族:AR，q=0.011，log比值比[odd ratio，OR]=1.79；FOXA1，q=2.94e-05，logOR=2.16；LTR5B家族:AR，q=5.68e-06，logOR=2.57；FOXA1，q=3.23e-07，logOR=2.84；图2F-G）。结果表明，成熟的良性前列腺中存在可与谱系特异性转录因子AR和FOXA1结合的调控性TE家族，提示重复DNA中的调控元件与非重复DNA中活跃的相同转录机制相关。
图2 不同的TE家族存在于多能干细胞和良性前列腺组织的活性调控元件中
TE定义了“重编程”和“恒定”的前列腺癌亚型
接下来研究者评估了正常组织转化为局限性前列腺癌会如何影响TE的调节特性，利用来自两个独立的前列腺癌队列（CPC-GENE队列，n=48；Porto队列，n=92）的H3K27ac ChIP-seq数据，发现了两个基于无监督层次聚类的前列腺癌亚组（图3A、B）。将未显示出调控性TE家族显著富集的亚组标记为“恒定”；由富含调控性TE家族组成的另一个亚组标记为“重编程”（图3C、D)。比较两个队列“重编程”亚组中发现的调控性TE家族，发现共有186个共享的调控性TE家族，分别对应CPC-GENE队列和Porto队列中97%和52%的调控性TE家族。研究发现，这186个调控性TE家族中有164个与多能干细胞中发现的TE家族重合，显示出与多能干细胞非常相似的TE超家族的重划分，表明“重编程”亚组的前列腺癌与多能干细胞高度相似。与此一致的是，基于CPC-GENE和Porto队列共有的186个调控性TE家族得出的“重编程评分”在“重编程”前列腺癌亚组中富集，在中等前列腺癌亚组中部分富集，而“恒定”前列腺癌亚组中则没有这一特征（图3G、H）。根据调控性TE家族的不同，局限性前列腺癌可分为“恒定”亚组和“重编程”亚组；与良性前列腺组织相比，“重编程”亚组与多能干细胞的调控性TE家族有相似之处。此外，无法观察到TP53、PTEN、SPOP、CHD1、RB1、NKX3-1、CDKN1B和MYC等前列腺癌驱动基因的突变状态与“重编程”和“恒定”亚组分层之间的关系（图3J）。
结果表明，部分肿瘤具有基于调控性TE家族的多能干细胞样生物学，并且与非重复调控元件相比，这些调控元件构成了控制前列腺癌细胞状态特征的独特机制。
图3 TE家族在一部分前列腺癌患者中被重新编程
来自“重编程”亚组的前列腺癌中的调控转座元件是谱系特异性转录因子雄激素受体的结合位点
接下来研究评估了来自局限性前列腺癌“重编程”亚组的164个调控性TE家族如何影响转录过程。利用转录因子cistromes数据库的ReMap图谱，从“重编程”亚组中寻找最容易与数量最多的调控性TE家族结合的转录因子。研究发现CPC-GENE队列和Porto队列的“重编程”亚组分别有25个和12个转录因子是独有的（图4A，B，C），而AR、GTF3C2、MLLT1、RBFOX2、TLE3和ZNF335等6个转录因子在两个队列中都被发现（图4D）。
来自癌症细胞依赖图谱（the Cancer Dependency Map，DepMap）项目的，基于核糖核酸干扰（ribonucleic acid interference，RNAi）的必需性筛选结果显示，与其他癌症的细胞系相比，AR是前列腺癌细胞系中唯一且明显更重要的转录因子（图4E）。DNA识别基序分析发现，在“重编程”亚组的Tigger3a和L1ME4b调控性TE中，雄激素响应元件（androgen responsive elements，ARE）和AR半位点基序分别显著富集（图4H）。结果表明，“重编程”亚组中发现的调控性TE可以作为AR的结合位点，支持AR依赖于局限性前列腺癌中重复DNA序列的功能。
图4 “重编程”TE家族作为AR的结合位点
“重编程”前列腺癌亚组肿瘤生长所必需的调控性TE
研究进一步探索了AR在调控性TE家族中的作用，发现在“重编程”亚组前列腺癌细胞系中，较低的重要性评分对应较高的AR依赖。随后研究者评估了“重编程”TE家族对前列腺癌细胞生长的影响。结果显示，在H3K27ac ChIP-seq数据中，“重编程”亚组模型22Rv1和LNCaP细胞系中Tigger3a的富集程度最高，而“恒定”亚组模型DU145细胞系显示Tigger3a缺失（图5C）。
接下来设计了Tigger3a元件特异性的引导RNA（guide RNA，gRNA）的组合，使用了包含6个干扰gRNA的组合作为阴性对照，在CUT&RUN测序试验中比较规律间隔成簇的短回文重复序列干扰（clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference，CRISPRi）对Tigger3a的招募情况，发现其优先结合Tigger3a元件。此外，在转染了目标基因的细胞中，与对照gRNA相比，Tigger3a前25%元件中的大多数H3K27ac信号显著缺失（图5E，F）。在所有条件下，底部25% Tigger3a元件的H3K27ac CUT&RUN测序信号强度没有变化（图5E）。提示gRNA组合能够优先将CRISPRi靶向Tigger3a，由此导致的H3K27ac信号减少反映了对靶向重复DNA序列的染色质编辑。
随后研究了靶向Tigger3a对AR与染色质结合的功能影响。结果显示，与对照gRNA组合相比，在核转染了Tigger3a gRNA组合的细胞中，超过25% CRISPRi结合Tigger3a元件的AR信号明显减少（图5G）。与对照条件相比，CRISPRi对Tigger3a元件的染色质编辑使“重编程”前列腺癌模型细胞系的生长降低至少20%，且并未改变“恒定”前列腺癌模型细胞系（DU145）的生长（图5I）。结果表明，Tigger3a型TE作为AR的调控元件，可直接调控其下游靶基因和前列腺癌细胞生长。
图5 Tigger3a元件是前列腺癌细胞生长的重要调控元件
细胞命运的决定依赖于多能干细胞对特异性转录因子的依赖性的转变，这些转录因子构成了细胞状态特异性表达模式。肿瘤的发生源于谱系特异性转录因子“劫持”多能干细胞的调控性TE，并且进一步发现该调控机制是如何依赖于活跃的染色质状态。本研究结果支持TE在肿瘤发生中的直接作用，并确定了通过利用改变其染色质状态来抑制其功能的方法。
随着医学技术的不断发展，前列腺癌基因组学、蛋白组学和转录组学等相关研究不断深入，在这一过程中涌现出了许多极具新意和应用前景的治疗靶点，有望进一步拓宽前列腺癌的药物库，改变临床诊疗路径。本项研究阐述了TE在正常细胞和前列腺癌细胞中作为调控元件的作用，发现前列腺组织中的调控性TE可作为特异性转录因子AR和FOXA1的结合位点。随后，研究通过基因编辑技术证实了Tigger3a等TE在前列腺癌生长中的作用，提出肿瘤的发生依赖于谱系特异性转录因子“劫持”多能干细胞的调控性TE，且该机制也依赖于染色质状态，为开发针对这一机制的靶向药物提供了理论依据。
但是基础研究的成果距离落地临床实践还有一段很长的路要走。AR信号轴在前列腺癌进展中起着关键作用，靶向AR信号轴的雄激素剥夺治疗（androgen deprivation therapy，ADT）仍是前列腺癌治疗的基石。促性腺激素释放激素激动剂（gonadotropin-releasing hormone agonist，GnRH-a）是最常用的ADT治疗药物，作为代表性的GnRH-a超长效剂型，曲普瑞林6月剂型疗效稳定，可以持续深度降低患者睾酮水平。一项包含9项前瞻性研究的汇总分析[2]，纳入920例晚期/转移/局部治疗后生化复发的前列腺癌患者，使用曲普瑞林治疗2-12个月。结果显示，曲普瑞林治疗第3、6、9和12个月时，睾酮水平＜20 ng/dL的患者比例分别为92%、93%、90%和91%。研究结束时，接受曲普瑞林1月、3月和6月剂型治疗患者的血清睾酮中位数分别为2.9（2.9-6.5）、5.0（2.9-8.7）和8.7（5.8-14.1）ng/dL。曲普瑞林6月剂型治疗的第3、6、9和12个月时，睾酮水平＜20 ng/dL的患者比例分别为97%、94%、92%和91%。
此外，更长的给药间隔也有助于提高患者治疗依从性。一项瑞典前列腺癌数据库（Prostate Cancer data Base Sweden，PCBaSe）登记研究[3]，纳入2006-2013年期间，12843例首次接受促性腺激素释放激素激动剂（gonadotropin-releasing hormone agonist，GnRH-a）治疗（n=8105）或再次接受GnRH-a治疗（n=4738）的前列腺癌患者，评估在接受GnRH-a治疗≥3年的患者中，影响依从性的因素。多变量分析结果显示，无论是在首次接受还是再次接受GnRH-a治疗的患者中，较长的注射间隔均可提高患者依从性。在首次接受GnRH-a治疗的患者中，180天注射间隔的依从性是90天注射间隔的2.61倍；在再次接受GnRH-a治疗的患者中，180天注射间隔的依从性是90天注射间隔的2.83倍[3]。
综上，曲普瑞林6月剂型为前列腺癌患者带来了更为长效的治疗新选择，可快速、深度降低睾酮水平，控制疾病进展，同时降低注射频率，提高患者治疗的便利性与依从性，赋能前列腺癌长程管理。
陈东 教授
中山大学肿瘤医院 泌尿外科
德国慕尼黑大学医学博士 副主任医师 硕士研究生导师
中国抗癌协会泌尿男生殖系肿瘤专业委员会 前列腺癌学组 委员
广东省泌尿生殖学会尿路修复重建学分会 常委
广东省抗癌协会泌尿生殖系肿瘤专业委员会 委员
广东省泌尿生殖学会微创学组 委员
前列腺肿瘤单病种专家，擅长泌尿系肿瘤的外科治疗，尤其是前列腺肿瘤的外科治疗和长程管理
参考文献
1. Grillo G, Keshavarzian T, Linder S, et al. Cancer Discov. 2023;13(11):2470-2487.
2. Breul J, et al. Adv Ther. 2017, 34(2) 513-23.
3. George G, et al. Sand J Urol. 2020 Feb;54(1):20-26.
编辑：Rudolf
审校：Nobody
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