目前，无义突变通读疗法主要有小分子药和tRNA两种技术路线，疗效主要关注翻译通读效率以及抑制NMD降解两方面。小分子类：一般为氨基糖苷类、大环内酯类抗生素，另外也包括噁二唑化合物、三萜皂苷化合物、偶氮杂蒽酮药物-Amlexanox、酰胺化合物等、核苷化合物等，目前已经发现50余种化合物分子。tRNA类：通过将反密码子工程化设计修饰，使之与终止密码子可以匹配，使用工程化的tRNA分子来识别并绕过mRNA上的终止密码子，使蛋白质合成能够继续进行，从而生成全长的功能性蛋白。小分子药目前主要分为氨基糖苷和非氨基糖苷两大类，目前主要面临通读效率低，安全性差的问题，且临床试验进展较慢，研发难度较大。主要包括庆大霉素、遗传霉素G418等，其作用机制是与核糖体转移酶中心结合，导致翻译时的密码子反密码子配对强度降低，近同源氨酰基-tRNA整体误读概率普遍增加，从而提高无义突变的通读概率，但广范围误读会导致一定的毒副作用，如听力损失、肾损伤。庆大霉素是最常用于无义抑制研究的氨基糖苷类药物，其他氨基糖苷类药有遗传霉素G418等，目前G418是已知效率最强的氨基糖苷类通读剂，一些细胞模型中NMD降解抑制可以实现40%的效率，翻译通读效率达到大约20%，但存在较强的毒性；不过目前一些氨基糖苷类衍生物新分子被发现，（NB124/ELX-02）体现了更强的通读活性且毒性可控，已经进入II期临床试验并得到积极结果（适应症Alport遗传肾病、囊性纤维化CF），初步临床结果显示NB124在无义突变的1类囊性纤维化（CF）患者中显示出积极结果：在1.5mg/kg/天剂量下，患者汗液氯化物减少5.4mmol/L，具有统计学意义，FDA已授予NB124快速通道。在NB124针对Alport的2期临床POC中，最新结果显示在所有3名受试者中，ELX-02平均改善肾脏足细胞形态指标幅度超过60%，结果同样较好，后续将继续推进III期临床。![]()
图4：部分氨基糖苷类细胞通读效率示意图
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图5：ELX-02II期平均改善肾脏足细胞形态指标幅度早期结果
（2）非氨基糖苷类
主要包括奈加霉素、大环内酯类抗生素、噁二唑化合物、三萜皂苷化合物、偶氮杂蒽酮药物-Amlexanox等。某些通读效率可达到G418的1.8倍；大环内酯类阿奇霉素特点是诱导通读所需的浓度比庆大霉素低100倍，但通读效率活性不及G418。
Ataluren是唯一上市的通读剂药物。Ataluren是一类噁二唑类化合物，也称为PTC124，其特点是安全性较高但通读效率仅为8~13%，其机制是通过与核糖体的多位点实现较弱结合实现诱导通读，因此与氨基糖苷类作用结合位点不完全相同，可以实现效果叠加而非竞争。不过，PTC124在CF（囊性纤维化）临床III期失败，DMD（杜氏肌营养不良症）同样未达到终点，但后因其亚组分析发现可延缓早期疾病进展而在欧洲获批，是唯一市售的通读药物。不过，PTC124在CF（囊性纤维化）临床III期失败，DMD（杜氏肌营养不良症）同样未达到终点，但后因其亚组分析发现可延缓早期疾病进展而在欧洲获批，是唯一市售的通读药物。
表1：目前Ataluren针对DMD开展的临床试验
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小分子药持续进展已发现50多种可能有活性的化合物。庆大霉素是唯一进入临床试验的氨基糖苷类药物，对CF和遗传性皮肤病具有潜在的治疗益处，但毒性是制约临床成药的关键问题，NB124是具代表性的氨基糖苷类衍生物，被认为是G418一种有前途的无毒替代品，Ataluren目前研究最多的能够诱导 PTC 通读的非氨基糖苷类药物，已被欧盟和其他一些国家有条件批准用于治疗DMD，并且是唯一市售的无义突变通读剂，但目前临床结局比较模糊，需要进一步的研究来阐明疗效。
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图6：目前小分子通读剂临床进展情况
3.2 阻抑tRNA治疗进展
这种技术通过使用工程化的sup-tRNA来竞争性结合mRNA的终止密码子，使mRNA翻译能够继续进行，从而生成全长的功能性蛋白。目前tRNA技术主要壁垒在于以下方面：
（1）氨基酸-tRNA连接（charging）效率：工程化修改反密码子的sup-tRNA可能会被氨基酸-tRNA合成酶（AARS）误读或不识别，从而影响charging正确匹配或效率很低。
（2）序列设计：tRNA分子具有除了反密码子，还有很多其他结构（如氨基酸接受臂、TψC臂等），单纯修改反密码子序列后，可能会出现tRNA氨基酸接受臂（同位受体）无法适应、二级结构不稳定等情况，目前对tRNA其他部分序列设计仍在不断研究探索。
（3）递送效率和免疫原性：递送方式主要分为两种，一种是体外合成tRNA后使用LNP递送至体内charging，另一种是使用AAV递送tRNA对应基因序列至体内转录修饰。体外合成的tRNA因为缺少天然的修饰更容易激发免疫反应，而体内合成天然tRNA修饰可以很大程度规避免疫反应，因此AAV路径从某些角度看相比LNP更优，由于AAV一次递送长期有效的特点，对风险控制的要求也更高。
（4）通读效率：tRNA疗法目前体现了高通读活性潜力，但也存在不确定性。目前尚无进入临床的产品。临床前部分研究显示，在对tRNA进行修饰后针对CF（囊性纤维化）疾病细胞模型的通读效率可以达50~60%或更高，远高于已知的小分子药的水平，但效果存在不确定性，一些研究在对tRNA进行修饰后针对CF疾病细胞模型的通读效率可以达50~60%，不过在Hep3B细胞模型中通读效率降至15~20%。
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图7：tRNA通读在不同密码子和不同细胞类型的通读效率
上游主要为CRO企业，提供载体研发、序列设计与编辑技术、细胞培养技术、生物信息学服务、临床前模型开发（细胞、动物模型）、生物分析方法开发等科研服务；中游为各类tRNA新药研发的企业；下游为各类遗传病临床适应症。目前上游CRO对tRNA这一细分领域仍在初期。目前上游技术针对tRNA领域的测序、设计、AAV系统开发、细胞模型开发等还处于早期阶段。具体载体技术、序列修饰技术的细节要求如下：（1）载体递送技术：主要使用AAV和LNP递送。递送tRNA的基因治疗载体包括：病毒载体、非病毒载体两类。AAV安全性高、免疫原性低、能够靶向特定组织等优点，适合于多种组织的长期基因表达，通过将设计tRNA序列和强启动子连接等传统AAV设计合成路径实现。但是由于sup-tRNA的通读效果会扰动AAV生产阶段会影响AAV衣壳的合成效率，目前是一个技术难题。LNP递送需长期重复给药，在mRNA疫苗中已得到广泛应用，易于大规模生产，但通过LNP递送一般适用体外合成tRNA的直接递送，体外合成路线可能存在免疫原性高活性低等问题。![]()
图8：tRNA在AAV和LNP递送路径细节对比
（2）tRNA设计与编辑技术：核心关注通读效率和氨基酸连接（charging）效率。目前对于tRNA的认识仍然较少，最常见方法是单纯修改天然tRNA的反密码子序列使之与终止密码子匹配；但是随着研究深入，发现并非所有tRNA都能适应反密码子的修改，单纯反密码子编辑可能会影响后续通读和抗mRNA降解的效果。单纯反密码子编辑可能导致氨基酸链接错误，例如色氨酸-tRNA反密码子修饰为UAG终止密码子时，大概率会charging赖氨酸（79%的概率）。目前，对于反密码子工程化设计编辑仍然有提升空间和壁垒。![]()
图9：tRNA结构和潜在修饰位点
（3）细胞和动物模型开发：目前主要由中游创新药研发公司自主开发，缺少商业化无义突变模型。细胞系构建是确保稳定和可重复实验结果的关键环节，由于tRNA领域相对较新，且关注无义突变这一特定类型，目前缺少成熟商业化模型，较多的细胞药物筛选Assay为中游创新药公司自主开发。动物模型例如转基因小鼠模型等情况与细胞模型类似，目前也是创新药公司自主开发。全球范围内，专注开发tRNA疗法的biotech公司主要包括：AlltRNA、Tevard Biosciences、Shape Therapeutics、hCBioscience，国内企业包括科动生物、启夏解码等。![]()
2018年在Flagship Labs成立，采用体外合成tRNA和LNP递送路径。成功应用机器学习来设计优化tRNA分子序列，具备全自动高通量的体外测试平台，以及动物测试模型，测试数据和设计序列数据会回输到Alltrna的平台中训练模型。技术路线上专注于化学合成tRNA和LNP递送，并且已经确定了满足tRNA所需的长度和纯化要求的化学合成工艺。此前公布的Arg-TGA体外数据显示，在25个疾病模型实现通读活性。目前尚未开展临床试验。2023年完成1.09亿美元B轮融资。![]()
图10：AlltRNA药物设计与测试平台
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成立于2017年，采用tRNA的AAV递送路径。公司目前有两个技术平台Suppressor tRNAs和Enhancer tRNAs，目前通过三种增强子tRNA的混合物，可以将受影响细胞中SCN1A（Dravet遗传性癫痫相关靶点）表达增强一倍，目前尚未开展临床，对外合作方面与Zogenix合作开发Dravet新药，2023年2月，Tevard宣布与Vertex合作开发基于tRNA的新型DMD疗法。2023年6月完成3亿美元A轮融资。![]()
图11：Tevard针对无义突变和单倍剂量不足开发2种疗法
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（3）Shape Therapeutics
成立于2018年，布局较为广泛的RNA技术和AAV技术（包括tRNA通读），目前较为关注神经系统疾病。具有Shape TX的RNA平台型技术（由RNAskip、 RNAfix、 RNAswap有效载荷技术、AAVid递送技术和SquareBio生产扩大技术等构成），技术核心由ShapeTX AI驱动。其中RNAskip是专用于无义通读的tRNA技术平台，目前专注于Rett综合征的MECP2突变。2021年8月宣布与罗氏公司开展战略合作，推进基于AAV的RNA编辑技术用于阿尔兹海默、帕金森等罕见疾病适应症的治疗方法的开发，合作总价值最高超过30亿美元。公司2021年7月获得1.12亿美元B轮融资。
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图12：ShapeTX三个重点布局
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（4）hC Bioscience
聚焦tRNA通读开发PTCX平台，临床方案目前正在探索针对相同无义突变类型引起的疾病，进行一篮子试验的可行性，以期同时在多个适应症同时获批。目前针对适应症是血友病、DMD、肿瘤，目前正在准备申报1期临床IND。可能采用的电穿孔的方式进行递送。2022年2月完成2400万美元A轮融资。
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图13：hC Bioscience重点管线领域进展
4.3 下游适应症
无义抑制疗法目前主要用于单碱基突变基因疾病，目前研发管线相对较多的适应症包括Duchenne肌萎缩症（DMD）、血友病、囊性纤维化、粘多糖贮积综合征、遗传性肾病（Alport）、雷特综合征（RETT）等。
无义突变在基因突变遗传病占比在10~20%之间，但单个适应症的患者量较少。例如，Duchenne肌萎缩症（DMD）由DMD基因突变所致，DMD在男性新生儿中的发病率约为1/3500，预计总体患病率约10万人口4.8例，其中点突变占25%左右，其中无义突变48.9%，目标患者群约7000人；囊性纤维化（CF）由CFTR基因突变所致，目前患病率6~12万人口1例，无义突变占比8%，目标患者群1000~2000人；血友病（Hemophilia）主要由凝血因子VIII/IX对应基因突变所致，患病率在每10万人口2.73~3.09例，其中点突变占比约34~38%，无义突变占比约为19%，目标患者群约1万人；遗传性肾病Alport年新生儿发生率约在5.3万分之一，其中约8~10%为无义变异；此外粘多糖贮积综合征、雷特综合征等多种遗传病的基因突变特征均类似，无义突变占比在8~16%之间。不过，从单适应症看，无义突变患者量绝对值较小。![]()
图14：血友病F8基因突变类型占比
目前多数遗传病仍相对缺乏特异性疗法，无义突变尚未广泛进入研发视野。以DMD为例，全球一线用药为糖皮质激素缓解肌肉炎症反应，无法解决DMD的根本病因，而近年开发的ASO和早期的Ataluren恢复的dystrophin水平较低，现有在研管线11条，仍主要延续ASO外显子跳跃和AAV提送基因替代疗法的研发思路，通读治疗相对新颖。而这一现象同样在血友病、遗传性心肌病、遗传性肾病等存在，例如血友病的一线治疗同样是对症治疗替代疗法，通过输注凝血因子VIII或IX的浓缩制剂，针对心肌疾病或肾病主要是通过RAAS途径延缓疾病进程，但无法施行特异性治疗解决病因，基因疗法仅有赛诺菲fitusiran和辉瑞的giroctocogene fitelparvovec进入III期临床，分别是siRNA路径以及AAV6递送FVIII基因替代疗法，其中辉瑞的管线已经于近期得到积极结果；遗传性心肌病、遗传性肾病目前管线主要针对RAAS、抗炎、保护器官功能等思路，而由于遗传类疾病振臂在一些适应症中本身较小，多数新药研发还主要关注于大适应症的范畴，例如针对遗传性心肌扩张病，近期活跃的II/III期临床9个管线，主要还是针对心肌扩张病症状开展的RAAS类（坎地沙坦、比索洛尔）、抗炎症氧化损伤（Mitoquinone Mesylate、ARRY-797、辛伐他汀）、增强心脏功能（溴隐亭、danicamtiv）药物研发，目前缺少针对遗传类疾病的基因疗法。而现有的针对这类遗传疾病的基因疗法开发现多集中在基因替代治疗或者ASO等疗法路线上，而由于此类治疗递送系统存在的一些天然缺陷（激发免疫反应或适用突变类型少），目前尚未广泛进入视野的通读治疗可能会成为新的方向。表2：近期心肌扩张病临床试验管线![]()
无义突变通读疗法为基因突变疾病治疗提供了一个新的研发思路，其针对突变类型而非单个适应症进行药物开发的模式极大拓展了治疗适应症的范围，有提高研发和商业化效率的潜力，为解决当前罕见病遗传病研发和商业化效率低的问题提供一个新的思路。但目前仍然需要关注一些现实困难，例如，目前对应每个适应症无义突变占比仍然较少，一种提高研发效率和投资回报效率的尝试是针对无义突变对多种适应症开发一揽子临床试验（hC Bioscience正在探索研究可行性），但国内尚无此先例。此外，通读治疗目前研发进展仍然较慢。tRNA通读治疗仍然处于早期研发阶段，针对tRNA的载体制备，tRNA序列合成以及测序等目前是在相对早期开发阶段，缺少充分临床数据，实际疗效如何仍需等待。而小分子通读药物则体现了更快的临床进度，例如ELX-02已经完成II期临床并取得积极结果，但小分子通读效率提高仍有较大提高的空间。总体需求上，目前针对Alport、Stargardt眼病、Rett综合征等遗传疾病，仍大多缺少特异性疗法，现有疗法均未对症治疗延缓进展，存在未满足需求。目前tRNA虽然尚无临床试验推进，但不同细胞模型中的通读效率最高体现了60%以上的水平，未来具有较大潜力，值得持续跟踪。
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