摘要：本章将首先简要介绍导致1975年Köhler和Milstein发表的开创性单克隆抗体工作的科学状态，该论文题为“分泌预定特异性抗体的融合细胞的连续培养”。这篇论文是现代抗体技术的基础之一，也是其支柱之一，这一事实由2018年全球十大畅销药物中有6种是单克隆抗体所证明。我们将回顾Köhler和Milstein所使用的原始技术，以及这些技术如何随着时间的推移演变为当前的标准协议。还将讨论抗体嵌合化和人源化等方法，这些方法促进了广泛治疗用途的人单克隆抗体的开发。杂交瘤技术很快发现自己与体外抗体发现技术（如噬菌体展示和其他各种展示方法，本书另一章将详细描述）竞争，但当转基因小鼠和大鼠变得广泛可用时，杂交瘤技术获得了持续甚至增加的兴趣，这些转基因动物的基因组中整合了人类而非它们自己的抗体编码基因。
1.第一批单克隆抗体
20世纪60年代和70年代，免疫学领域出现了激动人心的科学发展。当时的一个热点问题是如何从基因组层面组织编码抗体的基因，因为尚不清楚脊椎动物基因组如何在有限的基因组大小下编码大量不同的抗体。抗体的氨基酸链是如何结构组装的，或者抗体与抗原之间的接触是如何确切建立的，这些只是许多仍需解决的谜团中的一小部分。Anthony R. Rees所著的《抗体分子：从抗毒素到治疗性抗体》一书详细讲述了这一激动人心的科学时期的历史。
在20世纪70年代，用于研究特定抗体的实验材料一直相当有限。这是因为所有基于抗体的免疫反应都是寡克隆到多克隆的性质，从血液中分离的抗体产生细胞在培养中不会克隆性生长，因为它们是原始的。骨髓瘤是B细胞系的自发肿瘤，是当时可用于研究的最佳工具，也允许建立可以在实验室无限期生长的骨髓瘤细胞系。这些细胞系被用作抗体蛋白的来源，这些蛋白由轻链或重链组成，在某些情况下也包括完整的IgG。然而，这些骨髓瘤抗体的靶分子通常未知。当时27岁的乔治·克勒（图1，右）是一名博士后，当他遇到塞萨尔·米尔斯坦（图1，左）后，开始在英国剑桥的MRC分子生物学实验室（LMB）的他的实验室工作。
图1 塞萨尔·米尔斯坦（左）和乔治·克勒（右）。经Celia Milstein/MRC分子生物学实验室的友好许可转载。
在那里，克勒正在使用骨髓瘤细胞系，试图找到它们的抗原，以便进行进一步的实验，例如，通过突变改变它们的抗原结合特性。据说，克勒向米尔斯坦提出了一种替代策略，即通过将它们与不朽的骨髓瘤细胞系融合，使原本在培养中不会生长的抗体产生B细胞永生化。为了选择融合细胞，克勒必须找到一种方法来选择杂交细胞并抑制未融合的骨髓瘤细胞的生长。这可以通过使用将在下面详细解释的HAT培养基来实现。克勒和米尔斯坦随后对小鼠进行免疫，使用容易获得的抗原，即绵羊红细胞，从免疫小鼠中分离脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，选择杂交细胞，并表明持续生长的杂交细胞克隆正在分泌特异性识别绵羊红细胞的单克隆抗体。这项工作提交给《自然》杂志发表，并在1975年8月7日的期刊上发表。这篇现在的经典论文的第一页在图2中被复制。随后在1984年，克勒和米尔斯坦与尼尔斯·K·耶讷一起被授予诺贝尔生理学或医学奖，“因为他们关于免疫系统控制和发展特异性的理论，以及发现单克隆抗体生产原理”。
图2 G. Köhler 和 C. Milstein 关于单克隆抗体的原始出版物的第一页。经施普林格自然客户服务中心有限公司许可转载：“连续培养分泌预定特异性抗体的融合细胞” Georges Köhler 和 César Milstein # 1975。
2.抗体的序列、结构和功能
2.1.整体结构
不深入讨论免疫系统如何针对抗原挑战产生目标特异性抗体的细节，这是免疫学教科书（例如Janeway的《免疫生物学》或《细胞与分子免疫学》）中详细讨论的主题，这里将简要概述免疫球蛋白的氨基酸序列、产生的2D和3D结构及其功能。我们将重点关注IgG，因为这是目前在抗体工程和抗体治疗领域使用最重要的免疫球蛋白类别。
IgG分子由2个相同的重链组成，每个重链大约有440个氨基酸的长度，以及2个相同的轻链，每个轻链大约有220个氨基酸的长度。链被组织成大约110个氨基酸的域。所有域都共享经典的免疫球蛋白折叠，由七（对于恒定域）或九（对于变异域）个反平行β-链组成的双层三明治，排列在两个β-片中，具有希腊钥匙拓扑结构。环连接β-链。重链和轻链通过链间二硫键以及VH（变异重）和VL（变异轻）域之间以及CH1（恒定重1）和CK（恒定κ）或CΛ（恒定λ）域之间的非共价相互作用紧密连接。两个重链通过二硫键（在人类IgG1的情况下是两个）在铰链区共价连接，以及CH2和CH3域之间的非共价相互作用。人类IgG1在CH2域有一个N-糖基化位点（见图3b中的点）。IgG1的示意图和分子表示如图3所示。IgG分子由两个相同的重链组成，每个重链大约有440个氨基酸的长度，以及两个相同的轻链，每个轻链大约有220个氨基酸的长度。
图3 人类IgG1分子的结构。(a) 示意图，(b) 带状结构。重链以红色标记；轻链以蓝色标记。铰链区为绿色；域内和链间二硫键由黄线标示。抗原结合位点、Fc受体结合位点以及补体因子C1q和FcRn的结合位点用黑色箭头标示。带状展示是使用PyMOL分子图形系统，版本2.0 Schrödinger, LLC制作的。
2.2.变异域
变异域负责与抗原结合。VH域与VL域一起被称为抗体的Fv片段。每个VH和VL域上的三个环共同形成抗原结合位点。这些环被称为CDRs（互补决定区），或高变环，因为它们在不同抗体之间的氨基酸序列不同。CDRs中的氨基酸序列决定了抗体的抗原结合位点的化学和结构特性，从而使它们能够结合并适应几乎无限多的不同抗原结构。抗体结合的抗原分子上特定的点称为“表位”，而抗体上的相应点称为“互补位”。图4显示了人类抗HIV1抗体的Fv在3D中的展示（(a)和(b)）以及VL（c）和VH（d）域在2D中的展示。
图4 抗体的抗原结合Fv区域的结构。(a) 带状展示 (b) 与(a)相同，但CDRs显示为它们的溶剂可及表面。重链（VH域）以浅灰色显示；轻链（VL域）为深灰色。重链的CDRs以三种红色阴影着色，轻链的CDRs以三种蓝色阴影着色。该图是使用PyMOL分子图形系统，版本2.0 Schrödinger, LLC，使用结构文件1DFB.pdb制作的。(c) 和 (d) 1DFB.pdb的VL(c)和VH(d)域的二级结构的Collier de Perles展示。CDR环以不同的颜色显示在域的顶部侧面。Collier de Perles展示取自IMGT®，国际免疫遗传学信息系统®，在www.imgt.org 。
2.3.恒定域
抗体的恒定域，顾名思义，序列是恒定的，这意味着所有特定类别（例如IgG1）的抗体在免疫反应期间具有相同的序列，不会发生变化。恒定域可以分为两个区域：CH1和CK域对是抗体的Fab（抗原结合片段）的一部分，位于Fv和铰链之间，而重链的CH2和CH3域的同源二聚体形成Fc（可结晶片段）。Fc片段中的一个区域位于CH2域的尖端，靠近铰链区，是Fc受体如FcγR1（=CD64）、FcγR2（=CD32）和FcγR3（=CD16）的结合位点。这些受体存在于多种免疫细胞上，包括自然杀伤（NK）细胞和巨噬细胞，负责引发如ADCC（抗体依赖性细胞毒性）等效应功能，最终导致被抗体结合的目标被清除。此外，补体级联的第一部分C1q也在这里有其结合位点，可以引发CDC（补体依赖性细胞毒性）或CDCC（补体依赖性细胞毒性），以杀死被抗体结合的目标。有关这些效应功能的更多详细信息，请参阅免疫学教科书。抗体在体内的半衰期非常长（例如人类IgG1长达3周），这是通过另一个受体结合位点介导的。这个位点位于CH2和CH3域之间的界面区域。这里，FcRn（新生儿Fc受体）有其结合位点。在同一区域，我们找到了蛋白A的结合位点，它在研究中以及生物技术产业中常规用于通过亲和色谱法简便高效地纯化抗体。图5显示了Fc与其不同配体结合的复合结构。
图5 Fc片段与其主要配体接触的复合结构。Fc的两半分别以浅灰色和深灰色显示，糖链以品红色显示。(a) Fc与FcγR1（红色）、FcRn（绿色）和蛋白A的Z域（蓝色）结合的晶体结构。对于FcRn和蛋白A，仅显示了每个Fc分子的两个结合位点中的一个。用于构成本图部分的晶体结构文件是1OQO.pdb（Fc和蛋白A）、1IIS.pdb（FcγR1）和1FRT.pdb（FcRn）。(b) 补体C1q亚组分的A、B和C亚基与Fc结合。显示了来自6FCZ.pdb的冷冻电子显微镜数据。该图是使用PyMOL分子图形系统，版本2.0 Schrödinger, LLC制作的。
3.杂交瘤方法
3.1.起点：产生抗体的B细胞
如上简要提到的，克勒和米尔斯坦实验的目的是建立能够在培养中持续生长并分泌单一类型抗体分子的细胞系，即单克隆抗体。脾细胞是可以从免疫动物中分离的初级抗体产生细胞。具有相同特性的其他适当细胞来源包括血液淋巴细胞或从扁桃体中分离的细胞，尤其是当供体不是动物而是（恢复期或接种疫苗的）人类时，这些细胞更容易获得。然而，这些初级细胞没有在培养中长时间生长的能力。另一方面，肿瘤来源的骨髓瘤细胞系具有这种能力；然而它们不产生有意义的抗体。解决方案是将脾细胞和骨髓瘤细胞融合，从而产生杂交细胞，即所谓的杂交瘤，它们结合了两种理想特性，即抗体产生和持续生长。值得注意的是，“杂交瘤”这个术语最初并非由克勒和米尔斯坦提出。塞萨尔·米尔斯坦发表了一篇关于“杂交瘤革命”的叙述，他回忆说“杂交瘤”这个术语是由伦纳德·赫岑贝格在他的实验室1976/1977年休假期间提出的。
克勒和米尔斯坦设计的杂交瘤方法的简要图示总结如图6所示。杂交瘤方法的不同步骤将在下面详细描述，同时描述当今相应的标准实验室资源和程序。
图6 杂交瘤方法。漫画由Anthony R. Rees绘制。通过PLSclear获得牛津出版有限公司的转载许可，参考编号：33734。
3.2.免疫
为了在细胞融合后获得大量的杂交瘤，并使产生的杂交瘤成为高效产生高亲和力IgG抗体的细胞，非常重要的是对动物（通常是小鼠或大鼠）进行高效的免疫。免疫的结果将取决于多个因素，包括小鼠品系、免疫原的类型和强度以及免疫策略和时间表等。作为免疫原，可以使用整个细胞或细胞组分，当然也可以使用纯化的分子，如蛋白质、脂质、核酸或其他。作为一般规则，可以说用于免疫的材料纯度越高，产生的杂交瘤就越具有目标特异性。使用整个细胞或细胞裂解物进行免疫可以产生强烈的免疫反应，但这种反应并不一定针对所需的目标。另一方面，高纯度的抗原会导致非常有针对性的免疫反应，但根据抗原的性质，这种反应可能不会非常强烈。因此，需要使用与抗原一起给予的佐剂来有效刺激免疫系统。最广泛使用的佐剂是弗氏佐剂，无论是其完全形式（由矿物油和灭活的结核分枝杆菌颗粒组成）还是不完全形式（仅由矿物油组成）。由于使用弗氏佐剂可能对动物造成创伤，主要取决于注射部位和注射材料的数量，因此也可以使用许多替代佐剂，如铝、ALD/MDP（alhydrogel/muramyl二肽）或MF59。Asensio及其同事最近发表了不同免疫方案抗体库结果的比较，推荐读者阅读这篇论文作为探索详细免疫方案的起点。重复免疫（也称为增强免疫）在动物体内诱导产生高亲和力IgG抗体。高度激活的淋巴母细胞反过来非常有效地与骨髓瘤细胞融合。
3.3.适合融合的骨髓瘤细胞系
截至今日，有大量骨髓瘤细胞系可供用作生成杂交瘤的融合伙伴。所有这些细胞系都必须携带一个遗传标记，以便在融合程序后，如果它们没有与B细胞融合，就可以将它们杀死。这个标记通常是缺乏表达酶次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT）的能力，这种酶在所有正常细胞中都存在。缺乏HGPRT是基于一种通过在存在鸟嘌呤的有毒类似物（如6-硫鸟嘌呤或8-氮鸟嘌呤）的条件下培养先前突变的细胞来轻松选择的失活突变。只有在这种选择压力下存活的HGPRT细胞才适合用于杂交瘤实验。由于HGPRT是嘌呤和嘧啶合成的补救途径的一部分，HGPRT细胞依赖于嘌呤的新生合成。如果新生嘌呤合成被一种名为氨蝶呤的药物阻断，HGPRT细胞将无法存活。当一个HGPRT骨髓瘤细胞与一个正常的HGPRT+脾细胞融合时，结果是HGPRT+杂交瘤细胞，即使在氨蝶呤的存在下，只要提供外源性次黄嘌呤，它也能生长得很好。未融合的脾细胞没有在培养中分裂的能力，因此很快就会被排除，无需任何选择性措施。选择融合细胞和排除未融合细胞的这种策略由John W. Littlefield在1964年开发，并因选择性培养基HAT培养基而闻名，其中H代表次黄嘌呤，A代表氨蝶呤，T代表胸腺嘧啶。
克勒和米尔斯坦在1975年使用的骨髓瘤细胞系是P3-X63Ag8系，由Kengo Horibata和Alan Harris建立。这个细胞系对8-氮鸟嘌呤有抵抗力，并且在HAT培养基中不生长。
融合杂交细胞的一个理想特性是在许多细胞分裂过程中基因组稳定，因为染色体的丢失可能会改变细胞的基本生长特性或导致抗体产生丢失，当Ig基因携带的染色体受到影响时。因此，已经开发了许多小鼠、大鼠或人类来源的细胞系，可以根据用于融合的初级B细胞的来源进行选择。另一个重要特性是某些骨髓瘤细胞系产生内源性抗体链，这是不希望的，因为它会模糊所需单克隆抗体的表达或导致产生功能受到干扰的杂交抗体。因此，也选择了不产生内源性抗体的HAT可选用骨髓瘤细胞。最后，培养基要求是一个重要因素。典型的细胞培养基将包含一定比例的血清（通常来自牛或（胎儿）小牛）作为生长补充剂。由于通常希望避免在细胞培养基中使用这种动物衍生成分，也有能够在无蛋白、完全合成培养基中生长的骨髓瘤细胞。许多公司，以及非营利组织，如欧洲认证细胞培养物收集（ECACC；https://www.phe-culturecollections.org.uk/）和美国典型培养物收集（ATCC；www.atcc.org），是适合生产杂交瘤的骨髓瘤细胞系的验证供应商。
3.4.细胞融合
在他们1975年的原始工作中，克勒和米尔斯坦应用了仙台病毒（也称为日本血凝病毒，或目前的鼠呼吸道病毒）来诱导脾细胞和骨髓瘤细胞之间的细胞融合。尽管这种方法很有效，但在实验室中并不实用，也不太可靠或可重复，Galfré和Milstein在1981年发表的方法论文中描述了聚乙二醇（PEG）作为适合生产杂交瘤的融合剂，这种方法几年前就已经用于细胞融合。PEG具有脱水性质，导致细胞膜紧密接触。细胞膜融合随后自发且不受控制地发生，因此不仅发生一个脾细胞和一个骨髓瘤细胞之间的融合，还发生三个或更多细胞以所有可能组合的融合。这一主题将在本章后面的部分讨论（“当单克隆抗体不是单克隆时”）。无论如何，在理想的情况下，一个脾细胞与一个骨髓瘤细胞融合，形成一个有两个细胞核的异核体。在进一步不受控制的步骤中，两个细胞核必须融合，形成一个合核体。在随后的细胞分裂中，这组双倍染色体被减少到一组混合染色体，这组染色体在随后的细胞克隆代中稳定下来。染色体的进一步丢失永远不能排除，如果重链或轻链编码染色体受到影响，最终将导致一个不产生抗体的杂交瘤克隆。
除了PEG诱导的细胞融合外，还有其他方法也可以生产杂交瘤。其中，电融合可能是最常用的方法。电融合基于短高压场脉冲可以通过诱导脂质无序状态来破坏细胞膜，这些脂质在脉冲后几毫秒内重新排列，再次形成正常的脂质双层膜。当两个细胞的膜彼此紧密接触时，这可能导致细胞间融合。让细胞彼此紧密接触的最简单方法是离心。一种更精细的方法是应用介电泳原理，高频交流电导致细胞形成珍珠链，然后可以高效地融合。这种方法最早在20世纪80年代初被描述，Greenfield最近描述了一种协议。
3.5.鉴定单个杂交瘤克隆
在杂交瘤选择后，未融合的骨髓瘤细胞在HAT培养基中被淘汰（见上文）。与此同时，不分裂的未融合B细胞逐渐消失，杂交瘤克隆开始生长。为了将单个克隆彼此分离，从而实现单克隆培养，至关重要的是在融合后将细胞接种在微孔板中，每个孔只分布大约一个融合细胞。这个过程称为“限制稀释”。一旦杂交瘤克隆建立并且可以在显微镜下看到，它们的上清液将包含足够量的抗体，允许筛选生产力和特异性。为此目的有多种众所周知的方法，包括ELISA、表面等离子共振、生物层析干涉、流式细胞术以及生物测定法。
3.6.单克隆性
人们普遍认为，由杂交瘤产生的单克隆抗体是单特异性的。考虑到细胞融合过程中相当不受控制的条件，以及用于融合的骨髓瘤细胞的遗传设置，情况并非总是如此。在细胞融合过程中，不排除两个或更多产生抗体的B细胞与同一骨髓瘤细胞融合，该细胞随后携带编码重链和轻链的两个或更多基因。此外，骨髓瘤融合伴侣本身可能产生内源性抗体链，这些链可能与原始B细胞编码的链一起形成杂交抗体。已有轶事证据指向这一方向，这促使来自世界各地的一大批科学家探讨这个问题。在这个大型多中心研究中，分析了185个随机杂交瘤，其中68%是单特异性的，没有额外的生产链。然而，剩下的32%包含一个或多个额外的生产重链或轻链。在与杂交瘤工作时，应始终牢记这一点，在克隆杂交瘤的cDNA以进行进一步重组表达时要非常小心。
3.4.从鼠到人单克隆抗体
到目前为止，我们一直专注于由免疫小鼠的脾细胞产生的杂交瘤，从而产生鼠抗体。这些抗体作为各种体外环境中的应用试剂非常有用，例如在ELISA、Western blot、免疫组化等中。然而，它们不适合作为治疗人类的治疗剂，因为它们会被患者的免疫系统识别为外来物质，并产生人抗鼠抗体（所谓的HAMA反应）。这些抗药抗体将使治疗性抗体在治疗过程中逐渐失效。
解决这个问题有几种方法。最明显的是使用人的抗体产生B细胞与骨髓瘤细胞融合。由于出于伦理原因，当然不可能对各种有趣的抗原进行人体免疫，因此这种策略的使用是有限的。抗原特异性B细胞的唯一有用来源是外周血淋巴细胞（或从其他原因手术切除的器官中分离的细胞，例如在常规扁桃体切除术或脾切除术中）。像这样可解决的特异性范围自然非常有限。它主要涵盖有主动疫苗可用的疾病，或患者因中和抗体而从（主要是传染性）疾病中恢复的疾病。例如，已经以这种方式建立了各种广泛中和的人类抗HIV抗体。
在1980年代开发了更广泛适用的技术，使得可以使用鼠抗体作为起始材料，并从中衍生出或多或少的人抗体。这两种类型的抗体是嵌合抗体和人源化抗体，将在以下小节中简要描述，随后是生产完全人特异性单克隆抗体的方法。图7以图形表示这些不同工程抗体。
图7 从鼠源到人源单克隆抗体：(a) 完全鼠源抗体，(b) 鼠人嵌合抗体，(c) 人源化抗体，(d) 完全人源抗体；鼠源区域以绿色表示；人源区域以蓝色表示。在每种抗体下方，提供了来源亚茎以及一个示例抗体的名称。
4.1.嵌合抗体
由于抗体的高度保守的模块化结构，抗体的域以及全局抗体结构在不同物种之间具有高度相似性。科学家很快将注意力集中在这些相似性上，认为这些相似性应该允许使用抗体域作为模块化构建块，并将鼠和人的域结合起来，生产抗体嵌合体，一方面保留其结合特性，另一方面尽可能使其人性化。1984年，几乎同时，两份关于“嵌合”单克隆抗体工程的报告发表，其中一份将编码抗体变异域的鼠基因与编码抗体恒定部分的人类基因融合。Sherrie Morrison及其同事研究了一种针对磷酸胆碱的鼠抗体，并将其实变异域与人类IgG1或IgG2恒定区域融合，而Gabrielle Boulianne及其同事将一种鼠抗三硝基苯酚IgM的变异区域基因与人类IgM的恒定区域融合。在这两种情况下，完全保留了鼠源性抗原结合能力。
嵌合抗体很快进入了临床，今天其中一些，例如利妥昔单抗和西妥昔单抗，是畅销抗体，这意味着它们的年销售额超过10亿美元。
4.2.单克隆抗体的命名法
我们现在必须简要讨论单克隆抗体的命名法。它们遵循一种为单克隆抗体分配通用或非专有名称的命名方案。命名方案在“世界卫生组织的国际非专有名称(INN)”（www.who.int）中定义。所有抗体名称都以词干-mab结尾，作为后缀。在这个词干之前，放置一个表示mAb的免疫球蛋白序列所基于的物种的子词干。例如，-o-代表鼠，-xi-代表嵌合，-zu-代表人源化，-u-代表人抗体。在这个之前，一个或两个字母表示抗体的目标（分子、细胞、器官）类别。这种命名的例子包括-li-用于免疫调节（例如阿达木单抗）或tu-用于肿瘤（例如利妥昔单抗）。
4.3.人源化抗体
嵌合抗体是人类中免疫原性低于鼠抗体的巨大一步，因为在一个IgG的12个域中，它们只包含4个人源域。然而，科学家很快意识到，这可能对于人类可持续的长期治疗来说还不够好，在这种治疗中，抗体的免疫原性可能会降低治疗的有效性。1986年，在第一批嵌合抗体发表两年后，Greg Winter及其在剑桥MRC的研究小组发表了一篇在抗体工程领域取得重大突破的论文。他们采用一种针对半抗原（NP-cap）的鼠抗体，并将这种抗体的CDR序列分别引入人VH和VL域的框架序列中。这个过程被称为“抗体人源化”，至今仍是现代抗体技术的基石之一。已有许多人源化抗体获得临床使用批准，例如曲妥珠单抗或贝伐珠单抗。
4.4.完全人源单克隆抗体
20世纪80年代末和90年代初带来了抗体工程的两项进一步巨大进步，使科学家能够在不使用任何来自人的B细胞或其他人类材料（除了编码抗体的基因和相应的mRNA）的情况下生成完全人源的抗体。由于这些方法至今仍非常重要，本书中包含了每个方法的详细章节，本章只包含一个非常简短的描述。1989年，Marianne Brüggemann及其研究小组发表了一篇论文，其中描述了将未重排的人类免疫球蛋白片段（变异、多样性、连接和恒定元素）引入小鼠的生殖系。这些转基因小鼠的免疫使得产生完全功能性抗体的B细胞成熟，其中重链是人类的，证明这是在小鼠中生成人类抗体的一种方式。杂交瘤技术允许这些小鼠的B细胞永生化。这种将人类抗体编码基因片段引入小鼠基因组并从这些转基因小鼠中提取人类抗体的技术随后得到了非常动态的发展，现在在许多实验室和公司中广泛使用。今天，已有众多来自转基因小鼠的人类抗体被批准用于人类治疗；其中之一是nivolumab，这是一种识别PD-1的抗体，用于治疗多种不同类型的癌症。在另一种方法中，甚至完全不需要对动物进行免疫，Greg Winter及其团队在1990年展示了创建大型（含109或更多独立克隆）抗体变异域库（以所谓的单链Fv片段，scFv的形式，下面部分将描述）的可能性，并使用大肠杆菌将这些库展示在丝状噬菌体表面。通过称为“淘选”的过程，可以针对抗原特异性克隆筛选这些库。有关这些方法的详细信息，请参阅有关抗体展示系统的章节。以这种方式分离的scFv随后可以通过将其变异域编码区域与相应的恒定区域结合，重新格式化为完整的抗体。当scFv的序列是人类的时，因此可以相对容易地创建人类抗体。源自噬菌体展示的人类抗体早已进入临床，2018年全球最畅销的药物阿达木单抗就是这样一种源自噬菌体库的人类抗体。
5.抗体片段
今天使用抗体时，很可能不仅涉及完整的抗体分子，还涉及抗体片段的使用。本节将讨论其中最重要的片段抗原结合片段（Fab）和单链Fv（scFv）。在20世纪50年代和60年代，当抗体分子的结构和功能组织尚未完全清楚时，科学家使用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等蛋白水解酶成功地将抗体分子分割成功能性片段。这项开创性科学的详细历史在Anthony R. Rees所著的《抗体分子：从抗毒素到治疗性抗体》一书中进行了详细描述。发现木瓜蛋白酶有一个位于连接重链的二硫键上方的铰链区的切割位点。产生了三个片段，并对它们的属性进行了分析：两个片段能够以单价方式结合抗原，因此被称为Fab，即片段抗原结合。Fab片段由轻链的变异和恒定域（VL和CL）以及重链的变异和第一恒定域（VH和CH1）组成。产生的第三个片段没有抗原结合特性；然而，发现它可以相对容易地结晶，因此被指定为Fc（可结晶片段）。另一方面，用胃蛋白酶消化抗体产生了几个片段：一个大约是Fab两倍大小的片段，能够以双价方式结合抗原（称为F(ab')2）和一些由Fc切割产生的较小片段。这是因为胃蛋白酶在抗体中有几个切割位点，所有这些位点都位于铰链区的二硫键下方。木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化抗体的结果在图8中以图解方式显示。Fab片段保留了它们产生的抗体的抗原结合特性。然而，由于缺乏Fc，它们缺乏引发效应功能或激活补体系统的能力。它们在体内的半衰期也短得多，因为它们的体积小（尤其是分子量约为50-60 kD的Fab），并且缺乏FcRn的结合位点。由于体积小，二硫键数量有限，缺乏N-糖基化，Fab片段可以很容易地在各种表达宿主中通过共表达两条链重组表达，这在本书的另一章中有更详细的描述。Fab和F(ab')2片段的应用多种多样：它们被用作各种免疫学测试系统的试剂，也用作治疗分子，它们的小体积有利于更快更深的组织渗透，或者在需要缺乏效应功能的地方。此外，从噬菌体展示或酵母展示库中选择抗体的抗体格式包括Fab片段，以及一个更小的片段，代表了抗体的抗原结合特性，即Fv片段。早在20世纪70年代初，Givol及其同事通过对Fab进行有限的蛋白水解作用，衍生出抗体的Fv（变异片段）片段，并证明它包含VH和VL域，并且能够以与完整抗体相似的方式结合抗原，类似于Fab。
图8 IgG通过木瓜蛋白酶（上图）或胃蛋白酶（下图）的裂解碎片。
直到20世纪80年代末，人们才充分意识到并通过重组手段利用了Fv片段的实用性。1988年，Skerra和Plückthun描述了在大肠杆菌的周质空间共表达VH和VL域，并观察到形成了具有抗原结合能力的Fv片段，但由于缺少像Fab中那样的域间二硫键，其稳定性有限。
这个问题在1988年被两个独立研究小组巧妙地解决了，他们的想法是使用肽链连接剂将两个变异域连接起来，形成一个可以通过重组表达的单链多肽。连接剂大大提高了VH-VL异二聚体的稳定性，其长度由第一个域的C末端到第二个域的N末端的距离决定，以便让两个域在其天然构象中异二聚体化。Jim Huston及其同事描述了一种他们称之为单链Fv(scFv)的蛋白，由VH域、一个由15个氨基酸组成的连接剂和VL域组成。这些作者基于柔韧性和溶解度选择了连接剂的氨基酸序列，由三个连续的甘氨酸-丝氨酸基序组成：(GGGGS)^3。这种带有甘氨酸-丝氨酸连接剂的scFv格式自那以后被证明非常稳健且广泛适用，即使在设计30多年后的今天，仍然是最广泛使用的scFv格式。大约在同一时间，由Robert Bird领导的另一个研究小组构建了一个类似的单链多肽，设计为VL连接剂-VH，使用了稍长且更复杂的连接剂（图9）。
图9 单链Fv的示意图，展示了VH连接剂-VL的排列方式。连接VH域的C末端与VL域的N末端的连接剂以绿色线条表示。
自那以后，scFv分子在利用抗体特异性识别抗原的各个领域中变得非常重要。由于其由单条多肽链组成的简单结构，scFv通常可以容易地在大肠杆菌和其他表达系统中表达，因此它们是噬菌体展示抗体的首选抗体格式，类似于Fab片段。有关更多详细信息，请参阅本书中关于表面展示技术的章节。scFv及其更复杂的变体也进入了治疗应用的领域。特别是在双特异性抗原结合片段方面，这种最简单的抗体基本格式已被证明是一种极其有价值的分子，如本书中关于双特异性抗体的章节所体现的。
抗体的结构是什么？——抗体的IgG类别由四条链组成：两条相同的轻链和两条相同的重链。变异域（VL和VH）决定了抗体的抗原特异性。恒定域负责抗体的效应功能和在体内长的半衰期。
CDRs是什么？——CDRs，或互补决定区，是位于抗体变异域顶端的环状区域。VH和VL域各自贡献三个CDRs到抗体的互补位，并因此决定其特异性。
“互补位”和“表位”的含义是什么？——互补位是抗体中（位于CDRs中）实际接触抗原的区域。抗原中被互补位直接接触的区域是表位。
什么是骨髓瘤细胞系？——骨髓瘤细胞系来源于骨髓瘤肿瘤，已被适应在体外生长。
什么是HAT选择系统？——HAT选择系统基于细胞系中的突变（如骨髓瘤细胞系），该突变使编码HGPRT（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶）的基因失活。HGPRT是生产嘌呤和嘧啶的补救途径的一部分。因此，HGPRT细胞依赖于嘌呤的新生合成。当这种新生途径被药物氨蝶呤阻断时，HGPRT细胞将死亡。当一个HGPRT细胞与一个HGPRT+细胞融合时，就会产生一个能在HAT（次黄嘌呤-氨蝶呤-胸腺嘧啶）培养基中生长的HGPRT+杂交细胞。
什么是“限制稀释”？——融合后，新生成的杂交瘤细胞被非常稀释地接种，以便平均每个培养板的孔中只有一个细胞开始生长，从而只产生一种特定的单克隆抗体。
什么是嵌合抗体？——嵌合抗体是由鼠源抗体的变异域和人源抗体的恒定域组成的抗体。鼠源变异域决定抗体的特异性，而恒定域负责抗体的整体结构及其生物功能，如引发效应功能和长的体内半衰期。
什么是人源化抗体？——人源化抗体几乎完全由人类序列组成。只有CDRs来自鼠源抗体。
如何生成完全人源单克隆抗体？——生成完全人源单克隆抗体的两种主要方式是：一是使用携带人类免疫球蛋白编码基因的转基因小鼠，二是使用噬菌体展示库（或其他展示系统）的人源抗体片段。
什么是Fab和F(ab’)2片段？——Fab片段可以通过用蛋白酶木瓜蛋白酶消化抗体分子产生，也可以通过重组表达。它由轻链的变异和恒定域（VL和CL）以及重链的变异和第一个恒定域（VH和CH1）组成。Fab片段具有与其衍生的抗体相同的抗原结合特性，不同的是它们是单价的。相比之下，F(ab’)2片段代表两个通过铰链区的二硫键共价连接的Fab分子。
什么是scFv片段？——scFvs或单链变量片段是可以从抗体中衍生出的最小的抗原结合片段。它们通过重组表达，大多数以VH-linker-VL的构象表达。
关键信息总结：
单克隆抗体的生产最早由Köhler和Milstein在1975年描述。他们将小鼠的脾细胞（这些小鼠之前已用绵羊红细胞免疫）与骨髓瘤细胞融合。由此产生的杂交瘤克隆被发现能产生特异性结合绵羊红细胞的单克隆抗体。
用于生产杂交瘤的骨髓瘤细胞需要携带一个遗传标记，该标记允许在融合后杀死未融合的骨髓瘤细胞。通常，这个标记是HGPRT-，表示缺乏功能性HGPRT基因。在HAT培养基中，这样的细胞无法存活，而HGPRT+的杂交瘤细胞将不断生长。
抗体在物种间的一级、二级和三级结构高度保守。这允许它们以模块化的方式使用，并可以设计嵌合抗体。典型的嵌合抗体由鼠源抗体的变异域和人类恒定域组成。
融合后，杂交瘤细胞以非常稀释的方式接种，这称为“限制稀释”。这是为了确保在培养板的每个孔中，只有一个杂交瘤细胞克隆在生长，从而产生单克隆抗体。
抗体分泌到培养上清中，可以通过多种分析方法进行分析，以测试单克隆抗体的生产力、特异性和功能性。
最初，使用杂交瘤技术只生成了鼠源抗体。由于治疗需要人类抗体，因此开发了多种策略来生产更人类化或100%人类抗体，包括设计嵌合抗体、人源化抗体以及完全人类抗体。
抗体片段受到极大关注和重视，尤其是Fab和F(ab’)2片段，以及抗体的最小抗原结合片段，即所谓的scFv。
下章预告：抗体展示系统
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