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作者：王南，马倩倩，张俊仙，王杰，李小俊，梁艳，吴雪琼
第一作者及单位：王南，解放军总医院第八医学中心结核病医学部研究所；马倩倩，解放军总医院第八医学中心结核病医学部研究所，河北北方学院研究生院
通信作者及单位：吴雪琼和梁艳，解放军总医院第八医学中心结核病医学部研究所；李小俊，河北北方学院研究生院
Transcriptomics-based anti-tuberculous mechanism of traditional Chinese polyherbal preparation NiuBeiXiaoHe intermediates.
Wang N, Ma Q, Zhang J, Wang J, Li X, Liang Y, Wu X.
Front Pharmacol, 2024, 15:1415951.
doi: 10.3389/fphar.2024.1415951.
PMID: 39364045
研究背景
中西医结合是治疗结核病的有效方法。在以往的研究中，中药制剂牛贝消核（NBXH）在动物实验和临床实践中均取得了明显的抗结核效果。然而，NBXH 的作用机制尚未阐明。
研究方法
采集外周血单个核细胞（PBMC）提取 mRNA，利用基因芯片技术获得差异表达（DE）基因。最后，利用GEO数据库和RT-qPCR验证表达谱结果。
研究结果
小鼠感染MTB后，大多数上调的DE基因为免疫相关基因，包括cxcl9、camp、cfb、c4b、serpina3g和ngp。下调的DE基因包括lrrc74b、sult1d1、cxxc4和grip2。经 NBXH（尤其是大剂量NBXH）治疗后，基因的异常表达得到明显纠正。一些 DE基因已在多个 GEO 数据集中被报道或通过RT-qPCR实验在肺结核患者中得到证实。
研究结论
MTB 感染导致小鼠基因表达产生广泛改变，主要激活小鼠的抗结核免疫应答。使用大剂量NBXH治疗可部分修复异常表达基因，并进一步增强抗结核免疫，包括自噬和NK细胞介导的细胞毒性，同时对过度激活的免疫反应有一定的抑制作用。
正 文
结核病（TB）疫情仍然是一个严重的公共卫生问题。根据世界卫生组织《2023 年全球结核病报告》，全球新发结核病患者约1060万例，死于结核病的患者数约130万例，耐利福平结核病（RR-TB）约 41万例，RR-TB 和耐多药结核病（MDR-TB）的负担持续加重，2022 年全球 RR/MDR-TB治疗成功率较低（仅 63%）。目前，抗结核治疗存在诸多问题：（1）目前的抗结核化疗疗程较长，这些漫长而复杂的化疗方案对结核病患者和公共卫生系统都是严峻的挑战；（2）抗生素及抗结核药物的长期应用导致结核分枝杆菌（MTB）耐药性逐渐增强，需要更多种药物联合应用，并进行更长疗程的治疗。同时新药研发也进展缓慢；（3）抗结核药物毒副作用大：长期化疗造成肝肾功能损伤、胃肠道反应、神经毒性等不良反应，约有10%的肺结核患者因严重肝损伤而不得不停止抗结核治疗；（4）肺结核的发生发展与机体免疫功能低下、Th1/Th2 免疫反应失衡、免疫缺陷等距密切相关。因此，开发新药物、探索新疗法、建立新方案迫在眉睫。
中医药治疗结核病已有2000多年的历史，《黄帝内经》《十药神书》《医宗金鉴》等均有记载。在化疗药物发明之前，中医药在抗结核治疗和控制中发挥了极其重要的作用，积累了丰富的临床经验，正气不足是肺结核发病的重要基础，确立了“补虚杀虫”的治疗原则，强调调整人体内因，增强自我修复能力，以达到治愈肺结核的目的。中医治疗肺结核具有多成分、多靶点、多系统的综合治疗优势。因此，采用中医药辅助治疗肺结核，能够积蓄健康元气，提高患者免疫力，修复损伤，配合西药发挥抗结核作用，改善患者肺结核中毒症状，促进病灶吸收和空洞闭合，加速痰菌阴转，从而提高临床治疗效果。近年来，现代实验方法的应用阐明了许多中医药方治疗肺结核疗效的药理基础，推动了中医药方剂的现代化进程。多种抗结核中成药新制剂（如结核丸、肺泰胶囊、芪甲利肺胶囊等）获得了国家医药产品管理局批准的新药证书。
牛贝消核是临床上长期使用的有效抗结核中药验方，由川贝母、白芨、鱼腥草、桔梗、牛蒡子和糯米等六味中药组成。本团队之前的研究结果表明，牛贝消核提取物可以增强小鼠抗结核免疫功能，抑制MTB生长，减轻病变程度。目前，该中药验方已被开发为中成药制剂，已建立完备的制备工艺，但其抗结核作用的机制、作用靶点和调控途径尚不明确。因此，本研究通过基因芯片技术研究应用牛贝消核中间体治疗MTB感染小鼠的基因转录表达及调控途径变化，阐明牛贝消核提取物通过靶向基因及生物分子网络调控机体发挥整体抗结核免疫的作用机制。最后通过GEO数据库和RT-qPCR实验验证转录组分析结果的可靠性。
结果显示，小鼠感染MTB 3个月后，显著差异表达的DE基因主要涉及免疫、应激、细胞功能等方面，主要的DE基因包括cxcl9、camp、cfb、c4b、serpina3g、ngp、lrrc74b、sult1d1、cxxc4和grip2等。GO分析和Pathway富集分析结果也证明小鼠在MTB感染后NK细胞表面受体、Wnt和TGF-β等信号通路功能下调，黏附、分化、内分泌、转运等多个过程减弱，同时，在抗原识别、处理和呈递等相关过程中免疫防御相关应答增强，表明机体也在努力调动免疫途径抵抗MTB侵袭所导致的损伤。MTB感染对宿主基因表达的影响是全方位的，除免疫系统外，神经系统、内分泌系统等基因表达都出现了紊乱。神经体液调节系统对免疫系统功能的调节作用是十分广泛的，近年来越来越多的研究者关注神经体液系统对外源病原体感染引起的免疫应答的调控作用。比如胆碱能抗炎通路（CAP）激活能够限制肺部感染和减轻炎症损伤程度，还能抑制脾巨噬细胞NF-κB通路活化，减轻炎症反应，同时抑制脾巨噬细胞迁移等。除迷走神经外，交感神经和副交感神经也能调节炎症反应，Gang Cao等的研究表明Neuron-derived neuropeptide Y（NPY）能够精准调控脾脏炎症反应，充当免疫系统和中枢神经系统的“交互语言”。因此，MTB感染后出现显著变化的神经系统、内分泌系统的DE基因也有可能参与到神经免疫调控过程中。
应用牛贝消核提取物治疗MTB感染小鼠的转录组结果表明，牛贝消核能够增强免疫系统功能，减轻炎症损伤，发挥抗结核作用，但其与牛贝消核的应用剂量密切相关。研究发现，在一定剂量范围内，牛贝消核的抗结核疗效随剂量的增加而增强，相比于低剂量（2.4 mg/ml）与中剂量（4.8 mg/ml），高剂量（9.6 mg/ml）的牛贝消核中间体的抗结核治疗效果最佳。中药剂量是中药方剂极为重要的一部分，剂量与临床疗效密切相关，Chen JQ等和Chen YY等应用代谢组学技术研究中药的剂量-效应关系，本研究首次通过转录组学揭示牛贝消核剂量——疗效关系，结合传统的药理学和毒理学研究可为牛贝消核颗粒临床用量的确定提供依据。
高剂量牛贝消核能够增强免疫系统功能，减轻炎症损伤，发挥抗结核作用。高剂量NBXH治疗后会部分修复MTB感染引起的基因表达异常，进一步增强自噬、NK细胞介导的细胞毒性等方面的抗结核免疫应答，并在一定程度上抑制过度活化的免疫调节因子，减轻免疫介导的组织损伤。本研究首次通过转录组学揭示NBXH的剂量-反应关系，并进一步阐述了NBXH的抗结核作用机制，为中医治疗结核提供科学依据。
注 第0天将50只BALB/c 小鼠经尾静脉注射2×105 CFUs MTB H37Rv标准株。然后将小鼠分成5组，每组10只小鼠。组1小鼠每周灌胃5次低剂量牛贝消核中间体（2.4 mg/d），组2小鼠每周灌胃5次中剂量牛贝消核中间体（4.8 mg/d）、组3小鼠每周灌胃5次高剂量牛贝消核中间体（9.6 mg/d）、组4小鼠每周灌胃5次结核丸（6 mg/d）、组5小鼠每周灌胃5次0.5 ml纯净水。所有小鼠均于第 87天处死，并分离出PBMC mRNA 进行基因芯片分析。最后，使用GEO数据集和人PBMC mRNA 进行RT-qPCR实验验证转录组结果
图1 研究流程图
注：除非特别声明，本公众号刊登的所有文章不代表《中国防痨杂志》期刊社观点。
供稿：王 南
编辑：孟 莉
审校：范永德
发布日期：2024-10-17
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