| 前言 | 生长素是一种植物发育中的关键信号分子，主要通过激活生长素响应因子（ARF）家族的 DNA 结合转录因子发挥作用。ARF 在系统发育上分为三类（A、B 和 C）。 A-ARF 是生长素依赖性基因调节剂，并被生长素非依赖性 B-ARF所拮抗。基于对地钱 Marchantia polymorpha 的研究，C-ARF 似乎与生长素响应分离。 |
摘要：
生长素响应的关键取决于 A 类和 B 类生长素响应因子（ARF）蛋白的浓度和化学计量。在地钱 Marchantia polymorpha 中，A-ARF 和 B-ARF 均不稳定，本文确定了 ARF 降解所需的最小必要和充分区域，该区域对于发育和生长素响应至关重要。通过比较分析，我们发现 ARF 不稳定性可能先于生长素响应系统的出现。
鉴于 A-ARF 和 B-ARF 之间的竞争决定了生长素响应，它们的水平和化学计量是定义这种响应的关键参数。Weijers课题组最近在 Marchantia 中开发了所有生长素响应蛋白的荧光敲入报告基因，该植物编码每个 ARF 类的单拷贝。他们发现 A 类（MpARF1）和 B 类（MpARF2）ARF 均不稳定，这种不稳定性需要 26S 蛋白酶体。一些其他 ARF 已被报道为靶向降解的目标，但关于机制、生物学意义和进化起源的许多问题仍然存在。
为了解决这些问题，Roij et al 首先绘制了 MpARF2 中赋予不稳定性的区域图。作者表达了来自天然 MpARF2 启动子的 mNeonGreen（mNG）荧光标记、核靶向、蛋白质结构域。虽然 NLS-mNG 对照积累到高水平，但全长 MpARF2（NLS-FL-mNG）无法检测到，除非用Bz抑制 26S 蛋白酶体。虽然 mNG 与中区域（NLS-MR-mNG）或 PB1 结构域（NLS-PB1-mNG）的融合是稳定的，但仅 DNA 结合结构域（NLS-DBD-mNG）足以赋予不稳定性。同样，Bz 处理导致蛋白质积累。因此，MpARF2 DBD 包含不稳定所需的最小元件。
最近，在 Physcomitrium patens 和 Zea mays（玉米）B-ARF 中的突变被证明可以抑制蛋白酶体依赖性降解。在这两种情况下，突变都映射到相同的短基序，并且在 Arabidopsis thaliana AtARF2 中设计等效突变也减少了分解。因此，B-ARF 中的不稳定性可能具有单一的、共同的起源，起源于 ARF 进化。Marchantia 中存在单个 B-ARF 使得能够测试这一假设。事实上，在 Physcomitrimum 和 Maize 中所需的氨基酸在 MpARF2（MpARF2 中的 E297、S299 和 R300）中是保守的。当映射到我们实验确定的 MpARF2 DBD 结构时，我们发现这些氨基酸位于 α-螺旋 6 的 C-末端朝外的环中，可能介导 DBD 同二聚化。我们在 NLS-DBD-mNG 蛋白中设计了 E297K、S299N 和 R300Q 单突变以及 E297K+R300Q（E+R）双突变，并分析了积累和稳定性。除 S299N 外，所有突变均导致强核信号。相反，S299N 突变没有稳定蛋白质。因此，B-ARF 降解可能具有单一的进化起源，但正如所讨论的，ARF 及其蛋白水解伴侣之间可能存在共同进化。
作者故意在 DBD 中设计突变，以从潜在的植物生长和发育影响中解耦降解和积累。然而，尚不清楚 MpARF2 降解具有何种生物学意义。为了解决 MpARF2 降解缺乏对生长、发育和生长素响应的影响，我们在全长融合蛋白中设计了 E+R 突变。如预期所示，携带 NLS-FLE+R-mNG 的芽孢体表现出非常高的核 mNG 荧光水平，而表达 NLS-FLWT-mNG 的品系则没有，除非它们经过 Bz 处理。积累 MpARF2 的品系显示出一系列强烈的发育缺陷，而 NLS-FLWT-mNG 品系则没有观察到任何缺陷。大多数 NLS-FLE+R-mNG 品系是矮化的，表现出向地生长、异位顶切形成和无法产生芽孢体。一些品系确实形成了芽孢体，尽管它们主要在叶状体上形成，而不是在芽孢体杯内。然而，这些品系使我们能够探索 MpARF2 积累对芽孢体发育和生长素响应的影响。成熟的芽孢体显示出顶端（分生组织）切口形成的缺陷，通常显示出比常规两个切口更多的切口。对 S 期细胞的 EdU 染色证实了超数切口的存在。如预期的那样，由于 B-ARF 积累，NLS-FLE+R-mNG 芽孢体显示出生长素响应的强烈减少。因此，通过降解子介导的蛋白酶体降解调节 MpARF2 水平对于正常发育和生长素响应是必要的。
因此，等效突变稳定了 Marchantia、Physcomitrium、玉米和拟南芥 ARF。我们接下来测试了这些区域是否在功能上是等效的，通过将 Physcomitrium PpARFb2 的这个区域交换到 MpARF2 DBD 中。NLS-DBDPpARF2 交换-mNG 蛋白是不稳定的，但在用 Bz 处理时积累，并且降解机制在物种之间可能同源。
鉴于在 Marchantia 中，A-ARF 和 B-ARF 均不稳定，并且已经确定了对 MpARF2 降解既必要又充分的最小区域，作者接下来探寻 A-ARF 和 B-ARF 之间的不稳定性机制是否普遍。在 MpARF2（和 Physcomitrium、玉米和拟南芥）不稳定所需的区域中，MpARF1 和 MpARF2 之间存在一定的保守性。作者测试了 MpARF1 的等效区域是否可以使 MpARF2 不稳定，即交换了 MpARF2 NLS-DBD-mNG 中的这个短区域（图 1f）。作为对照，作者包括了来自 C 级 MpARF3 的等效区域，该区域在其原生环境中是稳定的。虽然 NLS-DBDMpARF3 交换-mNG 蛋白在没有 Bz 的情况下积累到高水平，但几乎无法检测到 NLS-DBDMpARF1 交换-mNG 蛋白。然而，当用 Bz 处理时，这种蛋白质积累到高水平（图 2e-g）。因此，MpARF1 和 MpARF2 中的同源区域赋予了相当的蛋白质不稳定性。
A-ARF 和 B-ARF 源自祖先 A/B-ARF 基因的一次重复，并在该重复之后进行了新功能化。发现 MpARF1 和 MpARF2 中相同的区域可以赋予不稳定性表明，该特征具有单一的起源，早于 A-ARF 和 B-ARFs 的分化。虽然 A/B ARF 的祖先状态尚不清楚，但这些蛋白质的现存代表存在于陆地植物的姐妹谱系，即链藻。作者从藻类 Spirogloea muscicola 中选择了 SmARF2 作为 Zygnematophyceae 的代表，它是与陆地植物最接近的谱系，并将同源区域从其 A/B-ARF（图 1f）交换到 NLS-DBD-mNG 中。NLS-DBDSmARF2 交换-mNG 融合物非常稳定，模仿了具有突变的降解子残基的融合蛋白的行为（图 2e-g）。这一结果与两种解释一致：要么 A/B-ARF 的祖先状态包括由该区域赋予的蛋白质不稳定性，随后在产生 SmARF2 的谱系中丢失。或者，祖先 A/B-ARF 状态是稳定的，并且在产生陆地植物的谱系中，在 A/B 分化之前进化了不稳定性（图 1h）。该藻类群的进化分化时间非常长（>600 Mya11），并且物种采样稀疏，使得这样的推断存在问题。对更多链藻物种的等效区域进行进一步探索可能有助于解决 ARF 降解的确切起源。
本文的工作确定了 Marchantia 中 ARF 降解的最小区域，并表明在 B-ARF 中，即使在只有一个拷贝的 Marchantia 中，维持不稳定所需的关键元件也是保守的。MpARF2 的不稳定性对于正常发育和生长素响应是关键的。对 MpARF1 的分析表明，介导不稳定性的能力很可能是蛋白质的祖先特性，早于 A-ARF 和 B-ARF 的分裂。鉴于生长素依赖性仅在 A/B 分裂之后进化，作者推断 ARF 不稳定性先于生长素响应系统的起源。一个关键的未来问题是，最小区域通过什么机制赋予不稳定性。该区域可能构成一个蛋白质-蛋白质相互作用界面，允许泛素连接酶或另一种蛋白水解衔接蛋白结合。事实上，S299N 突变没有稳定 MpARF2，而其直系同源突变稳定了玉米 ARF28，这表明降解界面存在差异，并且可能与伙伴蛋白共同进化。未来对 ARF 降解中其他组分的鉴定将有助于理解机制、多样性和降解在生长素控制的许多过程中的生物学意义。
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