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摘要: 为探究发酵菜籽粕对黄颡鱼的饲料表观消化率、肝脏及肠道健康的影响, 实验以黄颡鱼(Tachysurusfulvidraco)为研究对象, 共设置3组饲料, 分别为对照组(Control)、未发酵菜籽粕组(URSM)和发酵菜籽粕组(FRSM), 养殖实验共持续7周。
菜籽粕是我国第二大蛋白质原料, 其营养物质丰富, 氨基酸组成全面, 富含含硫氨基酸、蛋氨酸和半胱氨酸等氨基酸及硒、镁、铁、钙等矿物质。欧盟、中国、加拿大和印度是全球四大菜籽粕生产国/组织, 2020年我国菜籽粕产量达到909万吨,居于世界第二位。随着水产养殖规模的不断增加, 水产行业饲料供给不足, 而菜籽粕可作为潜在的新型植物蛋白源应用于水产饲料行业。但是菜籽粕含有的高碳水化合物、高粗纤维及大量抗营养因子成为其在水产饲料中的限制因素。抗营养因子过量会导致动物消化功能、抗氧化能力与免疫功能受损, 并且会降低摄食量和生产性能。有研究已表明, 菜籽粕经过发酵可以有效降解硫甙、单宁和植酸等抗营养因子, 并通过水解蛋白质为易吸收的小分子多肽等来提高菜籽粕的营养价值 。因此, 发酵菜籽粕可作为一种有潜力的饲用蛋白源应用于水产饲料行业。发酵菜籽粕在畜禽生产中的研究较广泛, 已证明它可以提高动物增重率、生产性能和免疫力, 增加动物对饲料的表观消化率, 增加矿物质利用率并改善肠道健康。然而, 发酵菜籽粕在水产饲料行业的应用研究较为缺乏。有研究表明, 发酵菜籽粕可以替代南美白对虾(Litopenaeus Vannamei)饲料中64.40 g/kg水平的鱼粉, 而未发酵菜籽粕替代鱼粉的水平仅为25 g/kg。与未发酵菜籽粕替代组相比, 发酵菜籽粕替代组可以明显增加鲫(Carassius auratus) 和真鲷(Pagrus major) 的生长性能及饲料利用率, 提高鱼体的抗氧化水平。鱼类的健康和免疫与抗氧化防御系统高度相关, 当鱼体受到的氧化损伤过重时, 甚至会引起鱼体细胞凋亡。黄颡鱼(Tachysurus fulvidraco)广泛分布于亚洲多个国家, 是中国最重要的淡水养殖物种之一。![]()
因此, 本实验以黄颡鱼为养殖对象, 先对其生长性能和表观消化率进行分析, 初步探讨了发酵菜籽粕对鱼体生长和营养物质消化吸收能力的影响。接着从黄颡鱼肝肠组织、肠道紧密连接相关基因表达水平、炎症反应、氧化应激及细胞凋亡等方面入手, 进一步讨论了发酵菜籽粕对鱼体肝脏及肠道健康的影响, 为发酵菜籽粕在水产饲料中的开发利用提供理论支持。发酵菜籽粕对动物肝脏及肠道结构的影响鱼类肝脏在几项重要功能的基础代谢中起着重要作用。有研究表明, 饲料中高含量的菜籽粕会抑制草鱼(Ctenopharyngodon idella)的生长, 并对肝脏等内脏结构造成损害。本研究同样发现FRSM组黄颡鱼肝脏组织出现明显病变, 肝细胞空泡化现象严重。据报道, 菜籽粕中的硫甙分解形成的腈类化合物会损害肝肾功能 , 这可能是未发酵菜籽粕对黄颡鱼肝脏造成损伤的原因之一。在本研究中, URSM组黄颡鱼的肝体比明显高于其他两组, 这也进一步证实了肝脏组织学观察结果。![]()
在本研究中, FRSM组黄颡鱼肝脏组织的病变情况得到明显改善, 空泡化的相对面积减少。通过对患脂肪肝的小鼠喂食发酵乳, 8周后发现小鼠肝脏空泡化数量明显减少。这说明菜籽粕可能通过微生物发酵降低菜籽粕中的抗营养因子含量, 从而改善菜籽粕对黄颡鱼肝脏造成的损伤。肠绒毛对营养的消化利用具有重要的功能, 有利于增加酶活性和养分吸收。在本实验中, URSM组降低了黄颡鱼肠绒毛高度, 饲料中添加发酵菜籽粕缓解了这一变化。有研究发现, 饲料中添加不超过10%的发酵菜籽粕时, 肉鸡十二指肠和空肠黏膜的绒毛高度增加。肠绒毛的高度和宽度是反映肠黏膜形态结构和功能完整性的最直接指标。有研究表明, 菜籽粕中的芥酸引起鱼类肠道充血和肠绒毛增生, 破坏了草鱼肠道结构完整性。![]()
由此可知, 发酵菜籽粕可能通过降解抗营养因子缓解菜籽粕对黄颡鱼肠道结构的损伤, 从而改善鱼体肠道健康。紧密连接蛋白在鱼类肠道屏障中发挥着重要的作用。在本研究中, 发酵菜籽粕添加缓解了菜籽粕引起的zo-1和zo-2的mRNA表达下调。Occludin和Claudin-1是跨膜蛋白, Zo-1和Zo-2属于闭合小环蛋白, 它们构成紧密连接复合体, 选择性地阻止腔内物质自由进出。有研究报道了菜籽粕中的抗营养因子会下调紧密连接相关基因的表达[28]。occludin、claudin-1、claudin-3和zo-2等紧密连接的下调会损害动物的肠道屏障。这说明未发酵菜籽粕中过量的抗营养因子使黄颡鱼的肠道屏障功能受损。Laukoetter等报道上调zo-1和occludin基因表达水平有利于小鼠肠屏障功能的恢复。由此说明, 发酵菜籽粕可以通过增强黄颡鱼肠道细胞间的紧密连接, 从而维持肠道屏障的完整性。![]()
研究表明屏障功能与炎症因子相关。在本研究中, 发酵菜籽粕缓解了菜籽粕诱导的黄颡鱼肝脏和肠道炎症因子相关基因的变化。同样, 发酵饲料喂养断奶仔猪, 空肠il-10、tgf-β表达水平显著上调 [33]。tnf-α、tnf-β、il-1β和il-6是重要的促炎基因,而il-10和tgf-β作为抗炎基因在炎症控制中也发挥重要作用[34]。因此, 本研究结果表明, 未发酵菜籽粕具有促进肝脏和肠道炎症的特性, 发酵菜籽粕激活了黄颡鱼的免疫反应基因。同样, Wang等通过研究也发现发酵菜籽粕添加可以提高肉鸡免疫力。鱼类的健康和免疫与抗氧化防御系统高度相关, 屏障完整性受损可导致炎症因子泄漏到血液循环系统, 从而引发应激反应或加重全身炎症反应。在正常情况下, Nrf2与抑制蛋白Keap1结合形成Keap1-Nrf2复合物, 应激时, Nrf2从Keap1释放并进入细胞核与抗氧化反应元件(ARE)结合, 促进抗氧化相关基因的转录。![]()
菜籽粕中的芥酸会诱导鱼肠道中Nrf2通路相关的氧化损伤。在本实验中,添加未发酵菜籽粕黄颡鱼肝脏和肠道keap1mRNA表达水平下调和nrf2的mRNA表达水平上调, 这说明未发酵菜籽粕导致黄颡鱼产生氧化应激。T-AOC代表生物体抵御ROS损伤的能力[37]。SOD是对抗氧自由基的主要防御系统之一。在本研究中, 未发酵菜籽粕饲喂的黄颡鱼的MDA水平升高, 抗氧化防御标志物(CAT、T-SOD和T-AOC)水平下降,饲料中添加发酵菜籽粕显著缓解了菜籽粕导致的氧化应激反应。丙二醛是过氧化过程的最终产物。使用菜籽粕与棉籽粕复合替代鱼粉的饲料饲喂黄颡鱼, 结果发现替代水平达到20%后可明显增加黄颡鱼肌肉的MDA水平。![]()
有研究表明发酵菜籽粕降低了MDA含量, 并提高了T-AOC和T-SOD活性,另外, 通过银鲑(Oncorhynchus kisutch)养殖实验发现,发酵豆粕替代10%鱼粉蛋白促进了肝脏抗氧化能力 。因此, 本研究表明微生物发酵可以缓解菜籽粕导致的肝脏和肠道组织的氧化应激, 从而促进黄颡鱼的生长。![]()
氧化应激是促进细胞凋亡的重要因素, 当氧化应激产生的ROS过量时, 会诱导细胞发生凋亡。在本研究中, URSM组黄颡鱼的促凋亡相关基因上调及bcl2基因下调。Bcl-2家族在细胞凋亡信号转导过程中起着重要作用, 其表达和调控是影响细胞凋亡的关键因素。其中, bcl2/bax比值是启动细胞凋亡的“分子开关”, 下调bcl2或上调bax表达可促进细胞凋亡。此外, bax和bcl2可以形成调节线粒体膜通透性的聚合物, 引起细胞色素C释放, 使Caspase活化, 最终引起细胞凋亡。![]()
p53蛋白激活可引起细胞周期阻滞、DNA修复和细胞凋亡, 其活性主要受MDM2的抑制。有研究表明菜籽粕中的芥酸会诱导草鱼细胞凋亡。这说明未发酵菜籽粕中过量的抗营养因子可能会导致黄颡鱼产生过多ROS, 从而诱导肝脏和肠道细胞凋亡。在本研究中, FRSM组饲料饲喂黄颡鱼缓解了细胞凋亡现象。有研究表明, 发酵菜籽粕提取物能大大降低ROS的水平, 从而可能减轻细胞凋亡。![]()
来自酵母细胞壁的多糖具有高抗氧化活性。因此, 菜籽粕可能通过发酵降低其中的抗营养因子含量并提高相关多糖含量, 从而缓解黄颡鱼肝脏和肠道细胞凋亡。综上所述, 使用发酵菜籽粕替代未发酵菜籽粕添加至饲料中饲喂黄颡鱼, 增加了黄颡鱼的生长性能和饲料利用率, 提高了黄颡鱼对原料的干物质、蛋白质、脂肪和能量表观消化率, 并且改善了菜籽粕引起的肝脏及肠道结构损伤、炎症反应、氧化损伤和细胞凋亡。由此可见, 菜籽粕经发酵处理可减少其对黄颡鱼肝脏和肠道健康的不利影响, 本实验不仅能够为黄颡鱼的养殖提供理论指导, 而且有助于发酵菜籽粕在鱼类实际生产中的开发应用。![]()
