肺癌是全球癌症死亡的主要原因,具有高发病率和死亡率。非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC)是肺癌中最常见的类型,占所有肺癌病理类型的80%~85%。尽管在NSCLC的早期检测策略和治疗方面取得了一定的进展,但识别新的生物标志物对于指导NSCLC的预后仍然非常重要。了解分子致癌机制和研究致癌驱动因子可以极大地帮助开发NSCLC的靶向治疗,并提供额外的治疗选择,从而增加患者的生存率。HOX基因家族,这是一类高度保守的基因,编码一种DNA结合转录因子,参与细胞分化、转移和血管生成。在哺乳动物中,有39个HOX基因,分为A、B、C和D四个簇。以往的研究表明,HOX基因表达的异常与某些类型癌症的进展有关,例如乳腺癌、肺癌和胶质母细胞瘤。HOXD基因位于染色体2q31上,是HOX基因的一个亚家族,包括HOXD1、D3、D4、D8、D9、D10、D11、D12和D13基因。在肺癌研究中,HOXD基因的异常表达与肺腺癌(LUAD)的发生和进展有关,但关于HOXD1在肺癌中的作用尚不清楚。近日山东第一医科大学(山东省医学科学院)临床与基础医学院李莲莲团队在《ONCOLOGY REPORTS》发表题为HOXD1 inhibits lung adenocarcinoma progression and is regulated by DNA methylation的文章,其利用ChIP(chromatin immunoprecipitation)-seq、TBS(Targeted Bisulfite Sequencing)、WB、RT-PCR等一系列实验探究HOXD1转录因子在小细胞肺癌的作用及其调控机制。爱基百客为该研究提供ChIP-seq和TBS的技术支持。研究者首先通过University of Alabama at Birmingham Cancer data analysis Portal分析了HOXD1在LUAD患者样本中HOX基因的表达模式,发现HOXD1在LUAD患者样本中表达下调。接着,通过Western blotting发现在LUAD细胞系中HOXD1蛋白表达水平较低。Kaplan-Meier分析LUAD中HOXD1表达水平的降低与总体生存率较差相关。此外,体外研究表明HOXD1过表达抑制了LUAD细胞的增殖、迁移和侵袭。在小鼠肿瘤模型中,HOXD1的上调被证明可以抑制肿瘤生长。进一步地,研究者通过靶向亚硫酸盐测序TBS和染色质免疫沉淀ChIP实验,发现HOXD1基因启动子区域发生了DNA超甲基化,并与DNA甲基转移酶(DNMTs)的作用相关。此外,上调的HOXD1作为转录因子,ChIP-seq实验及RT-PCR结果显示HOXD1增加了骨形态发生蛋白BMP2和BMP6的转录表达。
作者从UALCAN数据库用中LUAD分析HOXD簇的9个HOX基因的表达水平(图1)。数据显示肿瘤组中HOXD1表达水平明显低于正常组,而HOXD3和HOXD4表达水平在肿瘤组较正常组显著增加。HOXD8、HOXD9、HOXD10在肿瘤组和正常组间的表达水平无显著性差异(P>0.05)。此外,与正常肺上皮细胞系相比,LUAD细胞系中HOXD1的表达水平较低(图2A和B)。采用Kaplan-Meier回归分析HOXD1基因与LUAD患者的预后。结果表明,HOXD1表达水平低可能与LUAD患者的预后不良密切相关。图1 数据库分析肺腺癌中HOXD基因的mRNA表达水平图2 HOXD1基因在肺腺癌中的表达及其与生存预后的关系为了探索HOXD1在LUAD中的功能,作者用LV-NC和LV-HOXD1转染A549和H1299细胞以建立HOXD1过表达细胞系(图3A)。结晶紫染色、CCK-8测定和克隆形成实验测定表明,与对照细胞相比,HOXD1的上调显著抑制细胞增殖(图3B-D)。此外,为了确定细胞运动性,进行了细胞划痕实验(图3E)以及Transwell实验(图3F),与对照细胞相比,当HOXD1上调时,LUAD细胞的迁移和侵袭受到抑制。将A549 LV-NC和A549 LV-HOXD1细胞皮下注射到裸鼠体内,28天后处死小鼠并解剖肿瘤。观察发现,HOXD1上调组的皮下肿瘤重量低于对照组(图3G)。这些分析表明HOXD1可能具有抑制LUAD进展的能力。3. HOXD1启动子DNA甲基化并与DNMT的调节相关
为了研究LUAD细胞中HOXD1低表达水平的分子机制,使用UALCAN数据库中相关数据分析LUAD样品和正常样品中HOXD1启动子区域的甲基化水平。结果表明,LUAD样品的甲基化水平显著高于正常样品的甲基化水平(图4A)。这表明HOXD1的表达可能受到DNA甲基化的调控。使用MethPrimer预测HOXD1基因启动子区的CpG岛。在TSS的上游2Kbp至下游1Kbp中的三个CpG岛(图4 B)。此外,测量了BEAS-2B、A549和H1299细胞中HOXD1启动子区域甲基化水平,TBS结果显示,与BEAS-2B细胞相比,A549和H1299细胞中的总甲基化水平并没有显著差异(图4C)。值得注意的是,与BEAS-2B细胞相比,LUAD细胞中后段的一个CpG岛甲基化程度显著较低,而该启动子区域前段的两个CpG岛甲基化程度显著较高(图4D)。这些结果表明,在LUAD中,HOXD1启动子区域受DNA甲基化调控。进一步研究HOXD1高甲基化的调控机制,假设DNMT参与调节LUAD细胞中HOXD1的表达。为了验证DNMT是否是LUAD细胞中HOXD1表达的上游调节因子,用DNMT抑制剂地西他滨处理A549细胞96小时。使用RT-qPCR检测HOXD1基因表达水平,结果显示DAC剂量增加与HOXD1表达水平成正相关(图5A)。在此外,用靶向DNMT1、DNMT3A或DNMT3B的siRNA转染A549细胞,与阴性对照相比,HOXD1表达水平显著增加(图5B)。此外,将HOXD1启动子区域中TSS上游的2Kbp区域分成7个片段,并设计引物进行ChIP-qPCR(图5C)。结果显示DNMT与HOXD1启动子区域结合。DNMT1与HOXD1启动子的F1、F5和F7区段组合(图5D)。DNMT3A与HOXD1启动子的F1、F2、F3、F4、F5、F6和F7区段组合(图5E)。DNMT3B与F1、F2、F3、F4、F5、F6组合和HOXD1启动子的F7区段(图5 F)。ChIP-qPCR分析表明HOXD1启动子区域可能富含DNMT蛋白结合域。这些结果表明DNMT靶向HOXD1启动子区域,可能导致局部高甲基化,诱导LUAD中HOXD1的失调。图5 DNMT靶向HOXD1启动子区域并导致局部甲基化为了更好地探究HOXD1作为LUAD转录因子可能调控的下游靶基因,作者在HOXD1过表达A549细胞中进行ChIP-seq。ChIP靶基因GO注释分析表明,HOXD1的靶序列在生物过程中富集最多(图6A-B)。靶基因KEGG富集通路见图6C。根据ChIP-seq分析结果,筛选了24个与细胞过程相关的靶基因。然后,使用RT-qPCR确认这些基因的表达。这些结果表明HOXD1的过表达提高了BMP2和BMP6的mRNA表达水平(图6D)。图6 HOXD1的过表达增加了BMP2和BMP6的mRNA表达水平本研究表明HOXD1在LUAD中显著下调,并发挥肿瘤抑制作用。DNA甲基化调控的HOXD1通过增加BMP2和BMP6mRNA表达水平抑制LUAD进展(图7)。本研究结果可为非小细胞肺癌的早期诊断及治疗提供理论基础。
图7 HOXD1调控LUAD进展机制图
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