项目文章 | Cell Rep Med &SGLT2抑制剂达格列净可改善高尿酸血症肾病的肾纤维化

鉴于TIF是HN的共同特征，作者对HN患者的肾脏标本进行H&E和Masson染色，结果显示出有严重的肾小管病变（管腔扩张、上皮空泡化/扁平化、细胞核暴露和刷状缘损失）以及胶原沉积（图1A和1B），而免疫荧光（IF）结果显示HN患者的肾小管中纤维化标志物aSMA和FN1上调（图1C）。此外，HN患者的肾小管表现出线粒体形态异常，TOM20（线粒体标志物）荧光强度有所降低（图1D和1E）。

图1达格列净对HN患者肾纤维化的影响

作者通过经口服灌胃腺嘌呤（0.16g/kg）和氧酮酸钾（2.4g/kg）建立了HN的小鼠模型（图2A）。与HN患者中的观察结果一致，HN小鼠显示肾功能参数和组织病理学显著改变（图2B~F）。为了评估达格列净对HN小鼠的影响，作者使用1.0 mg/kg的达格列净对HN小鼠模型进行处理（图2G）。如预期的，HN +达格列净组表现出比HN组更低的血清UA、Cr和BUN水平（图2 H~J）。H&E染色结果也显示出达格列净还有效改善了HN小鼠的病理损伤（图2K~L）。此外，透射电子显微镜（TEM）分析表明，达格列净也缓解了线粒体的形态和结构异常（图2 M~N）。免疫荧光、WB结果均显示纤维化标志物aSMA和FN 1在达格列净处理后的HN小鼠中下调（图2O~R）。作者将达格列净的影响和对应目前所用一线降低UA药物别嘌呤醇治疗结果比较，HN +达格列净小鼠的肾功能和组织病理学表现出与HN+别嘌呤醇（ALL）小鼠相当的趋势。研究结果表明，达格列净有效缓解HN小鼠的肾功能不全和纤维化。

作者利用全基因组关联分析，HUA的发生率与负责尿酸盐转运蛋白表达的基因的遗传多态性之间存在密切关联。其中高度相关转运蛋白有GLUT 9、URAT 1、OAT 1、NPT 1、ABCG 2和MRP 4，在肾近端小管中尿酸盐的吸收或排泄中发挥关键作用。通过分析来自小鼠肾RNA-seq数据的大量差异表达基因（DEG）也显示出转运蛋白的表达失调。尿酸盐转运蛋白的转录调控在维持血清UA稳态中有着重要作用。与此同时，GO富集分析显示有“DNA-binding transcription factor binding”富集，启示参与DNA结合转录因子（TF）在HN的生物学过程中起着至关重要的作用。接下来，通过RNA-seq中相关DNA结合TF表达情况比较，锁定到转录因子ERRα（补充图S2B-G）。以往研究中ERRα已被认为是驱动与肾脏疾病严重程度的主要转录因子。

补充图2 HN患者和达格列净治疗小鼠中ERRα表达的变化。

作者将TEC和HK-2细胞分为四个亚组：对照组、对照+达格列净组、UA组和UA +达格列净组。体内观察、蛋白质印迹（WB）和IF分析表明，达格列净处理缓解了TEC和HK-2细胞中UA诱导的纤维化变化，而ERRα蛋白表达呈现上升趋势（图3A- 3C）。此外，达格列净处理后线粒体形态也发生了变化。在处理组中，观察到伸长的、管状的和完整的线粒体，而未处理对照组中观察到丰富的圆形、小的和肿胀的线粒体（图3D和3E）。用UA刺激的TEC中的耗氧速率（OCR）、ATP水平和线粒体形态改善以及活性氧（ROS）产生减少（图3F-3 I），进一步证明达格列净对于线粒体的有益作用。

图3 达格列净处理以及ERRa过表达在UA处理的TEC和HK-2细胞中的作用

传统观点认为达格列净对HN的保护作用是这是基于SGLT 2抑制，因此作者使用CRISPR-Cas9在HK-2细胞建立了SGLT 2敲除（KO）细胞系（图4A）。尽管SGLT 2耗竭，但观察到达格列净仍可显著预防UA诱导的纤维化和线粒体功能障碍。这表明，达格列净对HN的保护机制可能与SGLT 2的抑制无关（图4 B~G）。此外，SGLT 2耗竭并不影响ERRα表达（图4 B~C）。

图4 达格列净在UA处理HK-2  SGLT 2-/ ERRa-KO细胞的中的作用

为了研究ERRα与HN发展之间的直接关联，作者构建了肾小管特异性ERRα过表达（ERRα^ptKI）小鼠（图5A）。PCR、WB确定了ERRα的有效敲入（图5B~D）。在肾功能指数方面，与ERRα^Control小鼠相比，ERRα^ptKI小鼠未表现出明显变化，但在HN建模处理后，与ERRα^Control小鼠相比，ERRα^ptKI小鼠表现出显著缓解（图5E~ H）。同时病理学实验中HN模型化的ERRα^ptKI小鼠的肾脏显示出胶原积累、肾小管病变和线粒体损伤减轻（图5I-5 N）。此外，aSMA和FN1的荧光和灰度降低进一步证实了ERRα基因过表达对HN小鼠肾纤维化的抑制作用（图5O~P）。这些结果强调了ERRα在HN治疗中的治疗意义。

图5 肾小管特异性ERRα过表达在HN小鼠中的作用

OAT1（SLC 22 A6/NKT）是一种多特异性转运蛋白，主要定位于肾脏近曲小管的基底外侧膜且与尿酸分泌有关。已有研究表明OAT 1失调会破坏尿酸代谢并增加HUA的风险。最近的研究表明，雌激素受体a（ERa）可间接激活OAT 1，表明其活性部分受雌激素依赖性转录机制调节。RNA-seq分析结果表明干扰（si）-ERRα的HK-2细胞相对于对照的差异途径，包括酪氨酸代谢、多巴胺能突触、烟酸盐和烟酰胺代谢、Wnt信号传导途径、转化生长因子B（TGF-B）信号传导途径等途径（图6A）。先前已报道这些通路与HUA的发病机制有着密切的关联。随后，作者在HK-2细胞中利用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）（图6 B）鉴定了OAT 1基因与ERRα蛋白的结合位点，ChIP-qPCR结果进一步验证ERRα蛋白富集在OAT 1基因片段上（图6C）。OAT 1基因中的ERRα靶向基序motif见图6D，蛋白质-DNA对接模拟揭示了ERRα蛋白和OAT 1基因之间的最佳匹配模式（图6 E）。此外，在mRNA和蛋白质水平，观察到AAV-ERRα的ERRα过表达拯救了OAT 1水平，而si-ERRα下调了OAT 1表达（图6 F~ G）。双荧光素酶报告基因测定也证明了对应结果的一致性（图6 H）。此外，WB分析进一步支持了以上结果（图6 I~J）。总之，这些发现强调了ERRα对OAT 1有着直接的转录调节作用。

图6 HK-2细胞中的ERRa-OAT 1轴

为进一步验证达格列净对HN的有利作用是通过ERRα-OAT 1轴增强，作者进行了OAT 1蛋白表达与功能参数的相关性分析和IHC实验；结果显示OAT 1与血清UA呈负相关，与血清Cr和尿白蛋白与肌酸酐比率无明显相关性（图7 B~E）；与之前的研究结果一致，IHC结果观察到HN患者近端小管中OAT 1阳性细胞数量明显减少（图7A）。免疫荧光染色也证实了HN患者中OAT 1表达的降低（图7 F）,并且发现达格列净处理组可逆转OAT I表达（图7A和7 F）。此外，作者在HN或UA条件下对小鼠、TEC和HK-2细胞进行的WB，结果显示OAT 1蛋白水平下调，达格列净处理可抵消此作用（图7 G~K）。之后，将OE-OAT 1转染到TEC和HK-2细胞中，FN 1和aSMA的上调（图7 L~O）。总之，这些结果都证实了达格列净通过靶向ERRα-OAT 1轴在HN中保护肾纤维化的关键应用。

图7 HK-2细胞中的达格列净对HN或UA条件处理下肾小管细胞中ERRα-OAT 1轴表达的变化

上述结果表明ERRα-OAT 1轴的激活可能是达格列净诱导细胞凋亡的机制之一。HUA是CKD患者的常见现象。目前，达格列净已被批准用于CKD的临床治疗。然而，达格列净对CKD的治疗效果与ERRα-OAT 1轴之间的关系仍然是一个值得进一步研究的主题。作者利用三种不同的方法构建非HN CKD小鼠模型：高脂饮食（HFD）诱导的肥胖小鼠、db/db 2型糖尿病肾病（DKD）小鼠和单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠。随后，施用4周的达格列净治疗以评估其对肾功能指数和病理损伤的影响。在三种非HN CKD小鼠模型中，作者观察到了达格列净可以降低血清UA、Cr和BUN，以及减轻肾小管病变和胶原沉积；以及通过WB确定了ERRα-OAT 1轴的增强（补充图图S6）（图S6 E~ J）。这些数据对于此研究有进一步的拓展，说明ERRα-OAT 1轴调节剂达格列净也可以减轻非HN CKD小鼠模型和相应肾小管细胞的纤维化变化。

补充图6 达格列净在非HN CKD小鼠模型中的作用

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