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2024年11月11日，武汉大学人民医院泌尿科研究团队在期刊《Advanced Science》（IF=14.6）发表题为“STAMBPL1/TRIM21 Balances AXL Stability Impacting Mesenchymal Phenotype and Immune Response in KIRC”的研究论文。该研究表明靶向STAMBPL1/TRIM21/AXL轴可降低间充质表型，增强癌症治疗的抗肿瘤疗效。爱基百客为该研究提供RNA-seq的技术支持。肾细胞癌（RCC）每年影响全球超过40万人，约70%的病例被诊断为肾透明细胞癌（KIRC）。其被认为是一种免疫原性肿瘤，免疫治疗被纳入其治疗领域几十年。最近，免疫检查点抑制剂（ICIs）与其他ICI或TKIs联合在转移性RCC（mRCC）患者中显示出显著疗效，然而，一些患者最终对ICIs产生内在或获得性耐药性，导致治疗失败，因此迫切需要识别肾细胞癌中免疫逃避的潜在驱动因素，并提供有效的联合治疗策略。通过上皮-间质转化（EMT）获得间质表型是肿瘤转移的关键步骤。越来越多的证据表明，免疫逃逸和免疫疗法耐药可能是EMT程序的结果。这篇文章研究了STAMBPL1（STAM结合蛋白样1）在肾透明细胞癌（KIRC）中的作用，特别是其在肿瘤间充质表型和免疫逃逸中的作用。1. STAMBPL1有助于KIRC细胞间充质表型和免疫逃避
考虑到一些研究表明去泛素化酶（DUBs）在调节间质表型方面的潜在作用，以及它们作为癌症治疗药物靶点的良好前景，研究团队将注意力集中在DUBs上。为了系统地研究KIRC患者中DUBs的失调，研究检查了人类KIRC的癌症基因组图谱（TCGA）队列中DUB基因的转录水平，结果显示有三个DUB基因（USP50、TNFAIP3和STAMBPL1）在肿瘤中显著上调（图1A）。间质表型和EMT程序的特征是E-cadherin（编码基因为CDH1）的抑制，以及N-cadherin（编码基因为CDH2）和波形蛋白（编码基因为VIM）的诱导。通过对上调的DUB基因与间质表型相关的关键标记物进行相关性分析，发现其中只有STAMBPL1的mRNA水平在KIRC样本中与CDH1呈明显的负相关，而与CDH2和VIM呈正相关（图1B）。虽然TNFAIP3与CDH1没有相关性，但它与CDH2和VIM表现出显著相关性。然而，后续功能实验表明，TNFAIP3的敲低并未对KIRC细胞的间质表型产生影响。因此，选择STAMBPL1进行进一步研究。为了证实STAMBPL1在KIRC中的过表达，研究联合生物学实验和公共转录组数据集。与上述结果一致，与正常肾小管上皮细胞HK-2和邻近非肿瘤组织相比，KIRC细胞系和KIRC组织中的STAMBPL1在mRNA和蛋白水平上显著上调（图1C,D）。RNA-seq分析显示，STAMBPL1 敲除导致EMT相关基因的下调和免疫刺激基因的上调（图1E）。GSEA分析显示与细胞运动相关的通路下调，如黏附和肌动蛋白细胞骨架调控，而免疫刺激通路，包括干扰素介导的信号通路和抗原加工和呈递上调（图1F）。在两种KIRC细胞系（786-O和769-P）中沉默STAMBPL1，免疫荧光（IF）和免疫印迹分析表明， STAMBPL1 沉默导致间充质标志物减少，上皮标志物增加（图1G,H）。RT-qPCR表明导致STAMBPL1 沉默间充质标记物的下调（图1I）。随后，研究又进行了ELISA和流式细胞术。综合所有数据，STAMBPL1是KIRC细胞间充质维持和免疫反应的调节因子。图1：STAMBPL1有助于KIRC细胞间充质表型和免疫逃避
2. 抑制STAMBPL1通过泛素-溶酶体途径增强AXL的降解
根据文献报道，选择TAM受体蛋白作为研究对象。研究分析了对照组和STAMBPL1敲低细胞中的TAM（TYRO3/AXL/MERTK）受体蛋白水平，发现AXL的蛋白丰度在STAMBPL1敲低细胞中显著下降，而其他TAM受体的水平并没有变化（图2A）。然而， AXL mRNA水平没有任何变化（图2B）。在STAMBPL1敲低（KD）后，KIRC细胞表面的AXL也显著减少（图2C），而STAMBPL1敲低对细胞表面的TYRO3和MERTK水平没有影响。免疫组化（IHC）染色结果显示人类KIRC标本中STAMBPL1与AXL之间存在正相关，进一步支持了STAMBPL1可能正向调节AXL蛋白丰度的观点（图2D）。
由于在STAMBPL1下调后AXL蛋白的总量和膜上丰度显著下降，而AXL的mRNA水平基本保持不变（图2A-C），研究团队推测STAMBPL1可能调节AXL蛋白的降解或其mRNA的细胞分布和翻译。RNA原位杂交、蔗糖梯度离心和RT-qPCR等结果表明，STAMBPL敲低介导的AXL蛋白水平降低并不是由于AXL mRNA的细胞分布和翻译效率的变化所导致的。鉴于STAMBPL1通过其去泛素化活性在蛋白稳定性调节和细胞信号转导中发挥重要作用。为了检查STAMBPL1的去泛素化酶（DUB）活性是否对AXL的调节至关重要，研究对STAMBPL1中的氨基酸残基进行了突变，完全阻断DUB活性，同时保留其结合能力。WT STAMBPL1的重新表达，而不是催化活性的STAMBPL1突变体（E292A和D360A），导致了STAMBPL1 KD KIRC细胞中AXL蛋白水平的恢复（图2E）。以往研究表明，STAMBPL1的DUB活性经常导致目标蛋白底物中泛素链的去除，并改变蛋白稳定性。用环己酰亚胺（CHX）追逐法检测AXL蛋白在STAMBPL1 KD细胞中的半衰期，结果显示，与对照组相比，STAMBPL1 KD降低了AXL蛋白的稳定性（图2F）。蛋白质主要通过蛋白酶体或溶酶体途径降解。为了探讨哪条途径在调节AXL蛋白稳定性方面起主要作用，研究用MG132（蛋白酶体抑制剂）或氯喹（CQ；溶酶体抑制剂）处理KIRC细胞，并监测AXL蛋白水平随时间的变化。结果表明STAMBPL1主要通过溶酶体系统控制AXL蛋白的稳定性。随后，研究检查了STAMBPL1是否可以直接调节AXL的泛素化水平，泛素化实验结果显示，在HEK293T细胞中，STAMBPL1过表达减弱了AXL的泛素化，而去除STAMBPL1的去泛素化酶活性则消除了这一效应。此外，使用shRNA抑制STAMBPL1也增加了KIRC细胞中内源性AXL的泛素化。![]()
图2：抑制STAMBPL1通过泛素-溶酶体途径增强AXL的降解
3. STAMBPL1与AXL特异性互作，STAMBPL1 沉默效应很大程度上通过AXL表达来挽救
根据数据，STAMBPL1可以通过去泛素化来影响AXL的稳定性（图2F-I）。因此，研究团队推测AXL对于STAMBPL1诱导的KIRC细胞间充质和免疫逃避表型的增强是必要的。在解决这个问题之前，还需要进一步的研究来揭示STAMBPL1调节AXL泛素化的具体机制。免疫沉淀（IP）和pull down实验结果证明了STAMBPL1与AXL之间的直接相互作用（图3A, B）。
基于它们的互作，研究做了截短突变体来确定了STAMBPL1中与AXL结合的关键区域。结果表明STAMBPL1主要通过USP8_dimer结构域与AXL相互作用（图3C）。AXL蛋白包含一个胞外（EC）结构域、一个跨膜（TM）结构域和一个胞内（IC）结构域，根据其结构，研究构建了两个AXL缺失突变体。AXL突变体（氨基酸1-473包含EC和TM结构域）不能与STAMBPL1-USP8_dimer相互作用，表明AXL的IC结构域是STAMBPL1的结合位点。细胞外生长阻滞特异性因子6（GAS6）是一种配体，通过受体二聚体促进AXL的激活，从而启动信号级联，包括PI3K-AKT、MAPK、STAT和NF-𝜅B通路。因此，GAS6对STAMBPL1 KD诱导的AXL蛋白下调的潜在影响，以及STAMBPL1和GAS6是否是AXL的两个独立调控因子，有待进一步研究。首先，数据显示，KIRC细胞中STAMBPL1和AXL蛋白之间的相互作用在GAS6刺激下不受影响（图3D）。第二，GAS6处理可导致对照组KIRC细胞或STAMBPL1 KD细胞中AXL的短暂激活，然而，在GAS6刺激后，对照组细胞中的AXL蛋白水平仍显著高于STAMBPL1 KD细胞（图3E）。IF染色显示内源性STAMBPL1和AXL在KIRC细胞中有显著的共定位（图3F）。综上所述，这些发现表明，STAMBPL1直接与AXL IC结构域结合，而这种相互作用不受GAS6的影响。然后，研究STAMBPL1介导的间充质和免疫逃避表型调控中对AXL的需求，用慢病毒感染STAMBPL1 KD KIRC细胞过表达AXL，并通过免疫印迹法证实了其有效性。与预期的一样，AXL的异位表达显著挽救了STAMBPL1 KD细胞中间充质表型的减少和免疫刺激基因的表达的增加（图3G,H,J,K）。同时，在STAMBPL1沉默的细胞中，HLAA/B/C表面表达和CXCL10分泌的上调也被AXL的表达大大挽救（图3I,L），这与之前的假设是一致的。综上所述，这些数据提供了足够的实验证据，表明AXL的基因过表达在很大程度上消除了STAMBPL1 KD在KIRC细胞中的影响。![]()
图3：STAMBPL1与AXL特异性相互作用，STAMBPL1 KD效应在很大程度上被AXL表达挽救
4. TAMBPL1和E3连接酶TRIM21平衡了AXL K63连接的泛素化水平
研究已经证明，STAMBPL1抑制KIRC细胞中AXL的泛素化，然而，负责破坏AXL不稳定和促进其泛素化的特异性E3连接酶仍未确定。STAMBPL1 KD可以增强AXL的泛素化，增强E3连接酶与AXL之间的相互作用。因此，为了进一步研究AXL泛素化的分子基础，研究在STAMBPL1 KD 786-O细胞中进行了免疫共沉淀（Co-IP）结合质谱（MS）分析，以确定AXL连接的候选E3泛素酶。文献报道E3-泛素连接酶CBL在AXL的泛素化过程中发挥作用，但MS分析的结果没有检测到CBL和AXL之间的相互作用，而研究鉴定出了两个E3连接酶，TRIM21和TRIM28（图4A,B）。然后，研究检测了这两种E3连接酶是否会影响AXL蛋白的水平和半衰期。如图4C、D和补充数据所示，TRIM21 KD显著提高了AXL蛋白的表达和稳定性，而TRIM28 KD对AXL蛋白没有影响，说明E3连接酶TRIM21可能使KIRC细胞中的AXL不稳定。与这一观点相一致的是，通过IHC证实了人类KIRC标本中TRIM21和AXL水平的负相关。KIRC细胞系的Co-IP和GST-pull down检测结果证实了TRIM21和AXL之间的相互作用（图4E,F）。考虑到它们之间的相互作用，研究随后确定了TRIM21和AXL之间的结合区域。TRIM21的PRY-SPRY结构域（氨基酸残基287~465）和AXL的IC结构域（氨基酸残基473~894）是它们相互作用所必需的（图4G）。接下来，研究发现在TRIM21 KD细胞中，AXL的多泛素化水平显著减弱（图4H）。综上所述，E3连接酶TRIM21主要通过促进AXL的泛素化降解，在翻译后水平负调控AXL。
体内泛素化实验显示，TRIM21的异位表达显著促进了细胞中K63连接的AXL泛素化（图4I）。接下来，研究需要确定TRIM21介导的K63连接的多聚泛素化是否会触发溶酶体依赖性的AXL降解。由于STAMBPL1可以去除AXL上的泛素链，随后研究了STAMBPL1是否可以减少TRIM21介导的AXL上K63连接的泛素化。值得注意的是，外源性STAMBPL1的引入显著降低了细胞中TRIM21促进的AXL泛素化（图4J）。此外，在KIRC细胞中过表达STAMBPL1减弱了TRIM21和AXL之间的相互作用，相反，STAMBPL1 KD促进了TRIM21与AXL的结合（图4K）。值得注意的是，在TRIM21 KD 786-O细胞中，STAMBPL1沉默未能下调AXL蛋白水平，这意味着STAMBPL1 KD诱导的AXL泛素化和降解依赖于TRIM21（图4L）。总的来说，这些数据表明，STAMBPL1阻断了TRIM21对AXL的识别，从而保护了AXL免受TRIM21依赖的降解（图4M）。![]()
图4：STAMBPL1和E3连接酶TRIM21平衡了AXL K63连接的泛素化水平
5. 靶向STAMBPL1可抑制KIRC细胞的转移
转移是肾癌死亡率的主要因素，仍然是有效治疗的障碍，揭示这一过程的潜在机制将为转移性肾细胞癌（mRCC）患者提供新的治疗策略。此前研究表明，癌细胞可以劫持上皮-间质转化（EMT）发育程序和间质表型，以促进侵袭和转移启动。考虑到STAMBPL1在KIRC细胞的间质表型和免疫逃逸中的重要作用，研究团队接下来研究了STAMBPL1对肿瘤转移的影响。如预期，STAMBPL1的敲低（KD）减少了KIRC细胞在体外的迁移和侵袭（图5A-D）。
为了进一步阐明STAMBPL1/TRIM21/AXL轴在体内转移中的影响，研究使用786-O亚系在BALB/c裸鼠中构建了尾静脉癌转移模型（图5E）。与体外研究结果一致，STAMBPL1的沉默显著抑制了KIRC细胞在裸鼠中的转移种植能力（图5F），注射STAMBPL1敲低细胞的小鼠整体生存率明显高于注射对照细胞的小鼠（图5G）。这些STAMBPL1 KD效应可以在很大程度上通过AXL的表达或TRIM21 KD来挽救（图5F，G）。一致地，STAMBPL1敲低对肿瘤转移的抑制作用在NOD-SCID小鼠中也得到了确认，使用原位异种移植肿瘤模型，其中AXL表达或TRIM21敲低逆转了该效应（图5J，K），此外，各组的原位肿瘤质量没有明显差异（图5L）。同样，过表达STAMBPL1野生型，而不是酶死亡突变体，显著恢复了STAMBPL1 KD的肿瘤转移抑制，表明STAMBPL1以DUB活性依赖的机制促进了肿瘤进展（图H,I,M,N）。采用免疫印迹法确定切除的原位肿瘤中STAMBPL1、TRIM21和AXL的蛋白水平。综上所述，这些结果表明，STAMBPL1/TRIM21/AXL轴是抑制KIRC细胞转移的一个很有前途的治疗靶点。![]()
图5：靶向STAMBPL1可抑制KIRC细胞的转移。
6. STAMBPL1通过刺激p65核易位来增加PD-L1水平，沉默STAMBPL1可增强PD-1阻断的抗肿瘤疗效
以上研究结果表明，抑制STAMBPL1可显著上调多种免疫应答基因，从而可能增强其抗肿瘤免疫力。因此，研究团队推测STAMBPL1可能参与了癌症免疫治疗的调控。免疫检查点抑制剂（ICIs）在癌症免疫疗法中的应用已彻底改变了晚期癌症的治疗方式，特别是针对程序性细胞死亡-1受体（PD-1）的免疫检查点抑制剂在部分KIRC患者中显示了显著的生存获益。然而，导致对PD-1/PD-L1阻断耐药的机制仍然不够清楚。对TCGA-KIRC队列的分析显示STAMBPL1的表达与多个免疫检查点分子（包括PD-L1）显著相关（图6A）。为了证实STAMBPL1在KIRC中PD-L1表达中的作用，研究检测了786-O细胞和769-P细胞中STAMBPL1 KD后PD-L1的mRNA水平和蛋白丰度。稳定的STAMBPL1 KD导致PD-L1 mRNA和蛋白水平下降（图6B,C）。相反，STAMBPL1的异位表达导致了KIRC细胞系中PD-L1的显著上调（图6D,E）。重要的是，作为DUBs的一员，STAMBPL1没有影响PD-L1的泛素化水平，并且在KIRC细胞中没有观察到STAMBPL1-PD-L1的直接相互作用。这些结果表明，STAMBPL1可能不会在翻译后水平上通过去泛素化来调控PD-1的表达。
为了确定STAMBPL1在KIRC细胞中调节PD-L1的分子基础，研究重新分析了对照和STAMBPL1敲低的786-O细胞的RNA-seq结果。KEGG通路富集分析显示，STAMBPL1参与调节癌症中的转录失调和NF-κB信号通路（图6F）。由于多项研究表明NF-κB信号通路可能参与PD-L1的基因转录以刺激其表达， STAMBPL1是否通过NF-κB信号通路在转录水平上促进PD-L1的表达不得而知。NF-κB是支持肿瘤进程的转录因子，而亚单位RELA/p65的核转位对NF-κB信号通路是必不可少的。如图6G所示，STAMBPL1的沉默导致RELA/p65的核转位减少，而STAMBPL1的过表达则促进了核RELA/p65的积累。此外，研究还发现RELA/p65的沉默减弱了由STAMBPL1的敲低或过表达引起的PD-L1表达变化，这证实了NF-κB信号通路在STAMBPL1介导的KIRC细胞PD-L1水平增加中的重要性（图6G）。为了检验假设，随后的研究集中在STAMBPL1和NF-κB信号通路如何在转录水平上影响PD-L1水平上。序列分析发现，在PD-L1基因启动子中存在一个保守的共识序列——一个公认的NF-𝜅B结合位点（图6H）。为了确定p65是否特异性结合PD-L1启动子以直接激活转录，研究构建了含有野生型或突变型人PD-L1启动子的荧光素酶报告质粒，HA标签的p65表达结构增强了野生型PD-L1启动子的荧光素酶报告活性，但对突变型启动子没有影响，其中NF-κB的假定结合位点已被突变（图6I）。ChIP-qPCR和ChIP-半定量PCR分析进一步证实，在KIRC细胞中，内源性p65被招募到PD-L1启动子上包含结合位点的区域（图6J）。研究结果表明，p65通过与其基因启动子结合，促进了PD-L1基因的转录。研究结果表明，p65通过与其基因启动子结合，促进了PD-L1基因的转录。为了评估STAMBPL1在肾癌免疫治疗效果中的作用，研究使用对照Renca细胞或STAMBPL1敲低的Renca细胞构建了皮下肿瘤小鼠模型，并给予这些小鼠抗PD-1抗体（αPD-1）（图6K）。STAMBPL1的沉默协同增强了PD-1阻断的抗肿瘤效果，因为携带STAMBPL1敲低的Renca肿瘤的免疫功能小鼠在接受αPD-L1治疗后，肿瘤生长受抑制，整体生存率提高，而与之相比，携带对照Renca肿瘤的小鼠在接受αPD-L1治疗后效果较差（图6L-N）。小鼠体重、免疫荧光分析、免疫细胞比例等说明STAMBPL1可以通过促进RELA/p65的核易位来激活PD-L1的表达，抑制STAMBPL1可能使RCC对抗PD-1/PD-L1免疫治疗敏感。![]()
图6：STAMBPL1通过刺激p65核易位来增加PD-L1水平，而沉默STAMBPL1可以增强PD-1阻断的抗肿瘤疗效
7. STAMBPL1以AXL依赖的方式促进KIRC中的舒尼替尼耐药性
外科切除仍然是低风险局部肾细胞癌（RCC）患者的标准治疗（图7A），然而，许多RCC患者通常伴有区域性或远处转移。目前，转移性RCC（mRCC）的一线治疗包括免疫疗法（例如，纳武利尤单抗nivolumab）和靶向治疗的酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）（例如，舒尼替尼sunitinib）（图7A）。上述研究结果表明，STAMBPL1的缺失与免疫疗法的疗效相关，因此进一步研究了STAMBPL1是否调节KIRC对TKIs靶向治疗的敏感性。在786-O细胞中进行了药物筛选实验，研究发现sunitinib的半抑制浓度（IC50）值受到STAMBPL1的显著影响（图7B）。此外，转录组分析（使用GSE76068数据集）显示，与PDX模型对舒尼替尼的反应相比，在TKI耐药RCC患者来源的异种移植物（PDX）小鼠模型中，STAMBPL1表达上调（图7C）。与这一观点相一致的是，与舒尼替尼敏感的KIRC组织相比，来自患者的舒尼替尼耐药KIRC组织表现出STAMBPL1和AXL蛋白水平的升高（图7D）。
为了进一步表征KIRC的舒尼替尼耐药性，通过长期暴露于增加剂量的舒尼替尼（2-10 μmol L−1）10个月，建立了舒尼替尼耐药的KIRC细胞系（786-O-R、769- P-R和Caki-1-R）。值得注意的是，在生成的耐药KIRC细胞系中，786-O-R细胞对舒尼替尼治疗表现出最高的耐药性，这表明它们的半抑制浓度值更高。如预期，在耐sunitinib的KIRC细胞系中也观察到了上调的STAMBPL1和AXL（图7D,E）。为了阐明STAMBPL1对sunitinib耐药性的影响，研究对sunitinib敏感和耐药的KIRC细胞系进行了功能丧失或获得的研究。重要的是，研究注意到STAMBPL1的敲低增强了这些细胞系对sunitinib的敏感性，而异位过表达STAMBPL1则增加了肿瘤细胞对sunitinib的耐药性（图7F,G）。在体内异种移植瘤模型中也观察到类似的结果，沉默STAMBPL1可协同增强舒尼替尼的抗肿瘤作用，且无明显毒性（图7H-K）。这些研究结果表明，STAMBPL1通过AXL依赖的机制维持舒尼替尼耐药性，而沉默STAMBPL1可能会提高舒尼替尼治疗的疗效。![]()
图7：STAMBPL1在KIRC中以AXL依赖的方式促进舒尼替尼耐药性
在本研究中，STAMBPL1被确定为KIRC细胞中潜在的间充质维持调节因子，其沉默降低了间充质标记物水平，并诱导了免疫应答基因的表达。在机制上，研究发现STAMBPL1主要通过去除TAM受体之一成员AXL上的泛素化，正向调节癌细胞的间充质和免疫逃避表型。此外，STAMBPL1 KD还增强了PD-1阻断治疗和舒尼替尼治疗的抗肿瘤效果。这些发现为开发新的KIRC治疗方法提供了重要的分子基础。![]()
图8：模型图
武汉爱基百客生物科技有限公司（简称爱基百客），位于武汉高农生物园，是一家专业提供表观组学科研服务、单细胞与空间组学测序分析和高通量测序分析的新型生物科技服务企业。公司先后引入ChIP、WGBS、ATAC-seq、DNBSEQ-T7、10x Genomics、SeekOne® DD、DNBelabC-TaiM4和Stereo-seq等实验平台，不断提升公司的科研服务能力。
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