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表观遗传修饰对于基因的转录、剪接、稳定性、翻译、核小体组装和染色质结构等多个层面有着重要的意义，而CUT&Tag技术作为研究染色质和基因组调控的重要工具，在近些年取得了显著进展。传统的CUT&Tag通常是在大量细胞中进行实验，可能掩盖了细胞间的异质性，虽然CUT&Tag理论上也可以实现单个细胞层面的解析，但是由于通量的限制和实验操作的难度也并未得到很好的推广和应用。随着单细胞测序技术的发展，结合微流控平台及微孔板方法的单细胞CUT&Tag则允许研究者借助高通量细胞捕获方法对单个细胞中染色质的状态和转录因子的结合情况进行捕获和分析。这种技术可以揭示不同细胞类型之间或同一细胞类型中不同细胞的功能差异，提供更高分辨率的生物学信息，这对于理解发育、免疫反应及肿瘤微环境中的细胞多样性的研究至关重要。目前单细胞CUT&Tag技术主要包括以下几种方法：依赖特殊装置如Takara ICELL8的分选技术、CoBATCH技术、利用微流控芯片分离流动槽中的细胞、利用微液滴制备装置将单细胞分离到微液滴的技术、以及利用微孔和组合标签技术等方法。这些技术方法提供了从单细胞水平到高通量水平的多种选择，以适应不同的研究需求和实验条件。那我们今天来讨论下如何利用微流控系统实现单细胞CUT&Tag？
基于微流控的单细胞CUT&Tag的实验流程包括：细胞（核）悬液的获得及膜通透性的改变、抗体的结合、转座体的孵育及激活、液滴包裹单细胞、微球及扩增试剂的DNA标记、文库构建和生物信息学分析。![]()
单细胞CUT&Tag的实验流程
1. 细胞预处理：收集细胞，低速离心后加入细胞穿孔缓冲液裂解细胞，采用离心法或者ConA磁珠结合法对样本进行捕获；
2. 一抗结合目的蛋白：对处理后的细胞加入一抗（抗体浓度前期需进行探究），轻柔震荡后室温下混匀仪孵育2-4小时；3. 结合二抗：加入二抗，轻柔震荡后室温混匀仪上孵育1小时；4. 转座酶结合：加入pA/G-Transposase，轻柔震荡后室温混匀仪上孵育1小时；5. 转座酶激活：加入激活缓冲液，37°C，混匀孵育 1h；6. 单细胞液滴生成：准备样本悬浮液和珠子悬浮液，通过液滴生成装置进行油包水产物生成；8. 破乳及产物分选：油包水产物破乳回收DNA片段；影响高质量的单细胞CUT&Tag的结果，通常包括几个重要的因素：
首先，良好的细胞（核）质量是成功的一半，应选择新鲜的细胞和组织进行细胞核制备，对于细胞样品要求生长状态良好无污染，细胞活性＞85%。对于动植物组织建议提取细胞核，并保证细胞核形态完整，细胞核悬液背景干净。保证最终制备好的细胞总数不少于 30 万个，结团率＜5%，胞直径＜40μM；其次，对于抗体的选择，选择商业化的CUT&Tag已验证过的抗体，同时需要优化抗体和细胞的孵育比例；然后，对于核心转座酶需考虑其活性、兼容性、效率、稳定性等方面进行实验端优化；最后，对文库质量进行严格控制，理想的文库质检图应显示核小体分布趋势，通常是集中在约200bp、400bp和600bp的峰。最终，对测序后的文库进行生物信息学分析，良好的单细胞CUT&Tag数据特征表现为理想的细胞捕获量、有着与核小体分布一致的规律，包括单核小体、双核小体和三核小体的捕获、在每个细胞中捕获的unique fragments数量应足够多、有较好的分群效果能够区别不同的细胞类型、能够揭示细胞状态的多样性等。这些特征共同确保了scCUT&Tag数据的质量和可靠性，为深入理解细胞异质性和基因调控机制提供了坚实的基础。单细胞CUT&Tag是CUT&Tag技术的一个扩展，旨在在单细胞水平上进行分析。
研究细胞特异性调控：通过单细胞CUT&Tag，可以识别特定细胞类型或状态下的转录因子结合位点和组蛋白修饰，帮助研究者理解不同细胞类型如何通过特定的基因调控网络来执行其功能。
解析细胞发育过程：在发育生物学中，单细胞CUT&Tag可以用于追踪细胞在发育过程中的表观遗传变化，揭示细胞命运决定和谱系追踪的分子机制。
探索疾病机制：在肿瘤研究中，单细胞CUT&Tag可以帮助识别肿瘤细胞中的特定表观遗传标记和转录因子活动，从而为理解肿瘤的发生、发展及其对治疗的反应提供线索。
分析细胞间相互作用：单细胞CUT&Tag还可以与其他单细胞技术结合使用，帮助研究细胞间的相互作用及其对基因表达的影响。
- 开发新的生物标志物：通过识别与特定细胞状态或疾病相关的表观遗传特征，单细胞CUT&Tag有潜力用于开发新的生物标志物，以用于疾病的早期诊断和个性化治疗。
大量研究已在bulk水平上使用ChIP-seq和CUT&Tag解析染色质修饰，但在单细胞水平上的研究仍较少。使用这类前沿技术开展研究具有技术红利，并且能够带来较好的创新点。如您有单细胞CUT&Tag的技术需求，欢迎联系我们~
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项目咨询
武汉爱基百客生物科技有限公司（简称爱基百客），位于武汉高农生物园，是一家专业提供表观组学科研服务、单细胞与空间组学测序分析和高通量测序分析的新型生物科技服务企业。公司先后引入ChIP、WGBS、ATAC-seq、DNBSEQ-T7、10x Genomics、SeekOne® DD、DNBelabC-TaiM4和Stereo-seq等实验平台，不断提升公司的科研服务能力。
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