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成功妊娠涉及免疫细胞、内皮细胞（ECs）和基质细胞之间极其复杂的细胞通讯。子宫内膜蜕膜化是成功妊娠的首要和核心步骤之一，其特征是子宫内膜基质成纤维细胞（eSF）转化为被称为蜕膜基质细胞（DSCs）的特殊细胞类型，这一过程涉及间质-上皮转化（MET）。这些转分化干细胞可以提供营养，保护胚胎免受母体免疫系统的影响，并支持孕早期的母体血管化。子宫内膜蜕膜化是短暂的，尚未对其进行系统表征。2023年9月11日，北京大学杜鹏教授课题组在Cell杂志在线发表了题为“Spatiotemporal insight into early pregnancy governed by immune-featured stromal cells”的研究论文。研究使用单细胞转录组和华大单细胞空间转录组（scStereo-seq）技术首次对小鼠妊娠早期（E5.5-E9.5）着床位点的细胞组成进行了详细定义。根据不同细胞的空间动态分布，鉴定出了娠早期着床位点的8个不同功能中心。通过比较健康小鼠和复发性流产模型小鼠着床位点功能中心的差异，研究揭示了胚胎着床初期蜕膜微环境建立及稳态维持是成功妊娠至关重要的条件。![]()
研究将ROSA26CAG-tdTomato C57BL/6雄性小鼠与野生型ICR雌性小鼠杂交获得健康小鼠，并在妊娠早期（E5.5-E10.5）从着床位点获得蜕膜组织和表达tdTomato的胚胎外组织，进行10× Genomics scRNA-seq（图1A）。质量控制后，获得53,112个细胞，可分为13个主要的细胞群。其中，滋养层等8种表达tdTomato基因的细胞群来自胚胎；另5种不表达tdTomato基因的细胞群来自母体，包括DSCs、免疫细胞、子宫内皮细胞（uECs）、上皮细胞（Epi.）和平滑肌细胞（SMCs）（图1B、1C）。妊娠早期不同时间点的细胞组成反映了与先前文献一致的各种生物学事件（图1D）。DSCs（25,791个）、免疫细胞（5,089个）、uECs（4,523个）和滋养细胞（6,045个）的重新聚类获得了不同细胞亚簇（图1E）。特别是DSCs被分为了8个细胞亚簇，其中D8既表达DSC特异性基因，又表达滋养层特异性基因，被归类为DSC-吞噬TGCs。其余亚簇按GO分析重新定义（图1I），它们高度表达已知的DSC标记基因（图1H）。D1亚簇被认为是DSC前体，叫做eSF，D2亚簇则代表经历MET的前DSCs，D3-D7亚簇分别是增殖、生物矿物调节、营养、血管生成和成熟后DSCs。这些成熟的DSCs在E6.5时出现，尤其是血管生成DSCs在E8.5和E9.5左右显著增加，与大血管形成的增加相一致（图1J）。特征性基因的免疫荧光（IF）染色和原位杂交技术（asmFISH）结果进一步验证了这些DSCs亚簇并观察到它们的空间分布（图1K、1L和1M）。![]()
图1. 利用scRNA-seq技术解码小鼠着床位点的单细胞转录组图谱2. 基于scStereo-seq对动态功能决定中心的空间识别和可视化
来自E6.5/E7.5/E8.5/E9.5着床位点的7个组织切片被用作scStereo-seq，以获得具有动态组织和多种细胞类型的整个着床位点的全局视图（图2A）。研究成功鉴定并定位出7个DSC亚簇、9种免疫细胞、5个uEC亚簇、5个滋养层细胞亚簇和胚胎外VE细胞，它们显示出明显的层状结构空间分布，与H&E染色观察到的物理层一致（图2B、2C）。有意思的是，不同类型的具有相关功能的细胞还在着床位点的某些区域聚集，形成8个功能性决定中心（hub I-VIII）。其中，功能中心I至III主要由DSCs构成，是蜕膜化过程的主要发生区域；功能中心IV（免疫招募中心）富含免疫细胞；而功能中心V（血管生成中心）则富集血管内皮细胞和血管生成相关的DSCs；功能中心VI-VIII彼此靠近，主要由滋养层细胞亚簇组成（图2C、2D）。功能中心随时间的动态空间变化清楚地显示了妊娠早期的关键事件。![]()
图2. 利用scStereo-seq进行动态功能决定中心的空间识别和可视化
scStereo-seq的数据可以进一步用来研究子宫内膜蜕膜化的分子过程，具有典型纺锤样形态的eSFs位于蜕膜的最外层，前DSCs位于其附近。然而，许多靠近着床中心的成熟和成熟后的DSCs体积较大，呈单核或多核，其mRNA丰度远高于eSFs（图3A-3C）。细胞外基质（ECM）重塑是子宫内膜蜕膜化过程中MET和细胞状态转变的关键事件，对ECM基因的分析可将DSCs标记为6种模式，代表着不同的蜕膜过渡状态（图3D）。利用拟时序分析，研究证实eSFs首先转化为前DSCs，然后转化为增殖DSCs，此后产生两个功能分支：包括在系膜侧产生与血管形成相关的DSCs（D6）以及系膜对侧产生与营养供给相关的DSCs（D5）（图3E）。此外，通过MET相关基因和GO术语相对表达分析MET过程和体外诱导原发性子宫内膜基质细胞蜕膜化，均证明了此DSC轨迹的可靠性（图3F-3J）。转录因子（TF）在细胞命运决定中起着重要作用，研究从不同的DSCs中富集分析到了258个TFs，并定义了两个TF调节模块：免疫和增殖/凋亡（图3K、3L）。有趣的是，3′,5′环腺苷单磷酸（cAMP）响应元件调节子都可以激活下游核因子（NF）-kB通路，特别是在eSFs和前DSCs中受到刺激，暗示这些细胞具有免疫相关功能。![]()
图3. 子宫内膜蜕膜化过程中基质细胞的转分化
免疫细胞对蜕膜稳态至关重要。在免疫细胞的重新聚类中，有一类特殊细胞既表达免疫细胞相关基因又表达典型DSC标记基因，它们与血管生成DSCs的表达模式更近（图4A-4C），将其命名为免疫特性DSCs（iDSCs）。iDSCs根据转录特征可进一步分为3个亚簇，参与各种生物过程， iDSC0与血管发育有关，iDSC1与炎症反应有关，iDSC2则参与细胞溶解和凋亡（图4D、4E）。根据差异表达基因（DEGs）的细胞相关性分析显示，iDSC0与血管生成的DSCs具有相似的特征，而iDSC1和iDSC2分别具有髓细胞和NK细胞的特征（图4F）。此外，利用scStereo-seq数据可视化着床位点的这三个iDSC亚簇，观察到它们在E6.5时共定位于MET中心，而在E9.5时iDSC1与iDSC0/2分离（图4G）。IF、amFISH及原位测序（ISS）的结果证明了iDSC亚簇的空间分布（图4H-J）。受配体分析进一步揭示出高表达Tnfrsf9的NK细胞和iDSC2都可以通过CD137途径被血管生成的DSCs激活（图4K），从而导致穿孔素和颗粒酶基因表达。将iDSCs与人白血病细胞系K562孵育，观察到癌细胞溶解（图4L）。这些结果说明血管生成DSCs通过CD137信号激活iDSCs（主要是iDSC2）可能触发颗粒酶介导的凋亡途径，这可能有助于子宫系膜区胎盘生长的空间清除。![]()
图4. 一种具有免疫特征的双特征型DSCs的表征
5. iDSCs亚型帮助蜕膜微环境的建立和稳态调节
蜕膜血管的形成和免疫细胞的募集和抑制都是成功妊娠的必要条件，拟时间分析表明，uEC的命运特化从增殖的ECs开始，以两个经典的转换分支结束。scStereo-seq数据显示，各种ECs的动态空间分布和状态转换与血管生成DSCs和iDSCs高度相关，这可能在驱动中膜区血管中心的形成中起关键作用（图2C、2D和5A）。此外，iDSC0亚簇、血管生成DSCs及uECs亚簇均表现出血管生成信号基因的高表达（图1F、5B）。与uECs类似，免疫细胞也始终与iDSCs、eSFs和前DSCs共定位，在妊娠早期表现出动态变化（图2C、2D和5A）。iDSC0/1、eSFs和前DSCs一起介导免疫细胞动态募集，最终在ECs的两个物理层之间建立免疫细胞组装中心。免疫细胞募集信号配体主要表达于eSFs、前DSCs、iDSC0和iDSC1，这与它们在着床位点的空间基因表达一致（图5C）。配体-受体相互作用分析还显示eSFs、前DSCs和iDSC0/ 1具有不同的配体-受体识别机制，使它们能够招募特定的免疫细胞群（图5D、5E）。Transwell迁移实验为iDSCs的免疫细胞募集功能提供了直接证据，受刺激的iDSCs能够分泌趋化因子并增强永生化骨髓源性巨噬细胞（iBMMs）的迁移行为（图5F）。值得注意的是，妊娠早期免疫控制信号通路GALECTIN也得到激活，表明免疫细胞募集和抑制之间的平衡可能对维持蜕膜稳态很重要（图5E）。![]()
图5. iDSCs有助于蜕膜血管形成和介导免疫细胞募集
DBA/2-交配CBA/J小鼠为研究早期妊娠失败小鼠中iDSCs和相关功能蜕膜中心的潜在病理作用提供了模型，scRNA-seq被用于此模型鼠的E8.5/E9.5蜕膜组织，共鉴定出5种母体细胞类型，包括uECs、DSCs、免疫细胞、SMCs和Epi（图6B）。易流产小鼠和正常妊娠小鼠中的DSC亚簇及免疫细胞亚簇占比具有一致性，但uEC亚簇中多出现了炎性ECs和更高比例的血管生成ECs（图1G、6E）。值得注意的是，在转录组水平上，易流产小鼠和正常妊娠小鼠中的iDSCs存在明显差异，尽管在易流产小鼠中仍鉴定到3个iDSCs亚簇（iDSC0/1/2）（图6F），但iDSC1和iDSC2在总体传出和传入信号通路上显示出巨大变化（图6G）。此外，易流产小鼠的iDSC亚簇中富含与“对干扰素- α / γ的反应”相关的基因，说明易流产小鼠的iDSC炎症反应异常增加。相比之下，iDSC0的血管相关功能和iDSC2的细胞溶解功能在易流产小鼠中明显受到抑制（图6H），它们分别与血管生成DSC和NK细胞的相似性评分较正常妊娠小鼠里的低。![]()
图6. 功能性蜕膜中心和iDSCs在容易流产的CBA/J着床部点紊乱
7. iDSC的不正确定位和功能障碍导致小鼠蜕膜中心规范失败
利用scStereo-seq数据，研究进一步观察到易流产小鼠的着床位点存在功能失调的蜕膜中心，其特征是空间紊乱和细胞组成改变（图6I、6J和7A）。易流产小鼠E8.5着床位点的MET中心占比仅与正常妊娠小鼠E6.5的相当（图2D、6J），表明易流产小鼠的脱胎化过程严重延迟。此外，通过FACS证实，免疫细胞，特别是单核细胞和巨噬细胞的积累数量大大增加（图2D、6J、6K和7B）。易流产小鼠中，iDSC1与iDSC0/2一起定位在血管中心，而不是特异性地定位在免疫细胞组装中心。血管中心内还广泛存在各种免疫细胞，延伸到E9.5时两个eSF层之间的区域之外，这导致所有三个iDSC亚簇与各种免疫细胞之间的直接相互作用（图6I、6J、7A和7C）。总之，iDSC1在血管中心的错误定位可能导致多个免疫细胞异常募集到血管中心，这可能会干扰蜕膜血管形成。易流产小鼠中，异常的iDSC2还能激活Ccl4/6/8和Cxcl2从而让自身获得免疫细胞募集能力，而其颗粒酶诱导的凋亡功能可能由于颗粒酶表达降低而受到抑制（图7D、7E）。此外，易流产小鼠中异常定位于血管中心的巨噬细胞和增殖的巨噬细胞也可以激活Vegfb，巨噬细胞与血管生成DSCs和iDSC0一起增强了易流产小鼠的萌芽血管生成。相反，Angptl2、Angpt2、Calca和Adm的表达在血管源性DSC和iDSC0中均明显下降，导致血管成熟受到抑制（图7F–7H）。最后，利用人类蜕膜的scRNA-seq数据，研究也鉴定了一个富含免疫相关基因的人类iDSC（hiDSC）细胞群。对健康女性和复发性流产患者（RSA）的hiDSCs的比较分析显示，RSA患者的免疫应答基因异常富集，与易流产小鼠的iDSCs中的观察结果相似。未来需要进一步的实验验证来确认iDSCs在人蜕膜组织中的保守性。![]()
图7. 功能障碍和空间紊乱的iDSCs导致蜕膜区域失败和妊娠并发症
总之，这项研究更好地理解了小鼠妊娠早期着床位点的复杂事件，包括子宫内膜蜕膜化、免疫细胞募集和血管形成过程，这些都受被鉴定的双特性iDSCs控制。通过鉴别和详细描述功能中心，这项研究为旨在调查妊娠早期缺陷的进一步研究打下了一个很好的基础。有单细胞测序和Stereo-seq实验需求的老师，欢迎联系我们~![]()
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