题 目：热休克因子ZmHsf17正向调控磷脂酸磷酸水解酶ZmPAH1并增强玉米耐热性
发表期刊：Journal of Experimental Botany
发表时间：2024.9.26
发表单位：河北省农林科学院
影响因子：5.6
全球气候变暖严重影响了玉米在内的主要作物产量。为了应对这种不利影响，植物已经进化出多种保护机制，包括初级热感应、热休克信号传递和下游基因的转录调控。热休克因子（Hsf），尤其是HsfA2亚类，在响应热应激的基因转录调控中发挥关键作用。热休克蛋白（Hsp），作为常见的热响应基因，通常受Hsf调控。然而，是否存在更多的热响应途径，尤其是受HsfA2调控的靶基因，在玉米中尚不清楚。此研究通过联合ChIP-seq和RNA-seq为ZmHsf17（ZmHsfA2b）鉴定了一个新的作用靶点ZmPAH1，该基因编码脂质代谢途径中的磷脂酸磷酸水解酶。过表达ZmHsf17不仅增加了叶绿素含量和净光合速率，还增强了细胞膜的稳定性和一些关键膜脂成分的水平。
1. ZmHsf17的分离和表征
研究从玉米自交系B73的基因组中鉴定了五个ZmHsfA2成员。ZmHsf17的CDS从自交系H21中克隆并鉴定，其编码373个氨基酸的多肽。根据HEATSTER平台的分析进行鉴定、分类和特性描述（图1A），ZmHsf17的蛋白包括一个保守的DNA结合域（DBD）、寡聚化域（OD）、核定位信号（NLS）、核出口信号（NES）和芳香族、疏水性和酸性氨基酸（AHA）。根据Blastp的序列同源性搜索，ZmHsf17与从高粱、谷子、二穗短柄草、稷米和水稻中鉴定的其他HsfA2b成员表现出高相似性（图1B）。进一步的同源性分析和多序列比对表明，ZmHsf17与其他已知的HsfA2蛋白同源，并且具有这些HsfA2蛋白的典型保守域（图1C）。
2. ZmHsf17的亚细胞定位、转录激活活性和蛋白质相互作用
为了检查ZmHsf17的亚细胞定位，研究构建了C末端和N末端绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白。这两种融合蛋白在本氏烟叶细胞中瞬时表达，GFP蛋白本身用作对照。在对照中观察到GFP的绿色荧光在细胞质和细胞核中（图2）。无论是在最佳生长温度下还是在热应激下，ZmHsf17–GFP和GFP–ZmHsf17融合蛋白的荧光信号都集中在细胞核中（图2）。这些结果证实ZmHsf17定位于细胞核。
3. ZmHsf17的表达分析
为了确定ZmHsf17的组织特异性表达模式，研究设计了基因特异性引物，并通过qRT-PCR检测相应的转录本。结果显示，与其他组织包括幼根、成熟叶、花粉、穗和未成熟胚相比，ZmHsf17优先在幼叶和茎中表达，表达水平显著更高（图4A）。此外，为了阐明ZmHsf17在非生物应激反应和植物激素信号传导途径中的潜在作用，研究将样品暴露于各种应激条件，包括42°C热应激、4°C冷应激和20% PEG模拟干旱应激，以及来自SA、ABA和MeJA的信号。值得注意的是，ZmHsf17的表达在热应激下上调，随着应激暴露时间的增加，出现了短暂的峰值后逐渐下降（图4B）。然而，在冷和干旱应激下没有观察到显著增加（图4C、D）。此外，ZmHsf17的转录本被H2O2和SA处理诱导，并分别在90分钟和240分钟达到峰值（图4E、F）。经过外源ABA和MeJA处理后，ZmHsf17的表达随着处理时间的延长而逐渐下降（图4G、H）。
4. 玉米中ZmHsf17的过表达提高了耐热性
为了评估ZmHsf17对热耐受性的贡献，研究将ZmHsf17融合Flag标签转入到Zheng58自交系中生成转基因玉米系，便于检测和富集蛋白质进行功能研究。在标准温度条件下，野生型Zheng58和三个转基因系（17_68、17_88和17_89）的幼苗在株高和保持绿色特性方面没有显著差异（图5A）。经过热应激处理后，转基因玉米幼苗的生长表型明显比野生型更健壮（图5B）。通过CIRAS-2光合仪器测量第二片叶的光合参数，三个转基因系的净光合速率高于Zheng58（图5D）。此外，三个转基因系的叶绿素a和b含量也比Zheng58多（图5E）。这些结果表明，在高温发生时，玉米幼苗的叶绿体遭受了严重损害。然而，ZmHsf17的过表达可能减轻了叶绿体的热损伤，并保持了较高水平的光合作用。叶片的膜结构是在热应激后最重要和最脆弱的部分。较高的相对电导率（REC）表示更高的渗透性和膜结构损伤程度。测量了所有组第二片叶的REC。在标准生长温度条件下，ZmHsf17过表达系和野生型之间的叶REC没有显著差异。然而，热应激提高了所有系的叶REC，而ZmHsf17过表达系的REC增加幅度更小（图5F）。总体而言，ZmHsf17可能参与保护膜结构和维持玉米叶片在热应激下的光合作用。
图5. 在玉米中过表达ZmHsf17改善了对热应激的耐受性
5. ChIP-seq和RNA-seq的整合分析
为了找到ZmHsf17调控的下游基因，研究对ZmHsf17过表达系17_89和Zheng58玉米幼苗在42°C热应激后的ChIP-seq和RNA-seq数据进行了联合分析。通过分析RNA-seq数据中基于转录水平上调的基因，鉴定了热应激后Zheng58中的1371个差异表达基因（DEG1）和ZmHsf17过表达系中的2380个（DEG2），以及ZmHsf17过表达系在热应激下与Zheng58相比3398个（DEG3，图6A、B、C）。对这3398个差异上调基因进行基因本体（GO）富集分析，以阐明在热应激下富集的分子和生理过程，这些过程可能受到ZmHsf17的正向调控（图6E）。GO富集分析揭示了与应激反应显著相关的生物过程（BP）术语，特别是那些涉及“对应激的反应”、“对化学物质的反应”、“对非生物的反应”和“对热的反应”（图6E）。分子功能（MF）类别的GO富集分析突出了与“DNA结合”、“转录因子活性”和“蛋白质二硫氧化还原酶活性”相关的途径（图6E）。细胞组分（CC）类别的GO富集分析揭示了与“细胞内膜界定的细胞器”、“线粒体”、“液泡”和“质膜的固有成分”相关的基因显著富集（图6E）。
图7. ZmHsf17潜在靶基因的转录水平已经ZmPAH1的染色质结合峰图
6. ZmHsf17直接结合ZmPAH1的启动子
为了验证ZmHsf17与ZmPAH1启动子之间的相互作用，扩增并测序了ZmPAH1的启动子区域（-2 kb）。观察到在相应结合峰附近有一个典型的HSE（图8A）。设计了围绕HSE的引物，并在热应激后对玉米叶片进行了ChIP-qPCR实验。ChIP-qPCR结果表明，与IgG对照组相比，用Flag抗体沉淀的样本中ZmPAH1启动子区域的DNA片段富集了约3倍（图8B）。这一证据证实ZmHsf17能够体内结合ZmPAH1启动子区域内的HSE位点。
图8. ZmHsf17直接与ZmPAH1的启动子结合并激活荧光素酶报告基因的转录。
7. ZmHsf17过表达系在热应激下的脂质重塑
为了更深入地了解由ZmHsf17介导的热应激反应相关的脂质组学变化，进行了无标记的LC-MS/MS实验。这种方法允许对暴露于热应激的ZmHsf17过表达系和野生型Zheng58玉米植物的叶样品进行比较定量脂质组学分析。脂质组学分析检测到总共738种脂质，属于26个脂质亚类。主成分分析显示Zheng58和ZmHsf17过表达系的主要脂质组分之间存在明显的分离，而在每个组内部的主要组分之间没有观察到明显的分离（图9A）。在检测到的总脂质含量中，ZmHsf17过表达系显示出比Zheng58显著更高的水平（图9B）。在ZmPAH1合成的脂质亚类中，观察到过表达系中TG、MGDG和DGDG的含量均显著高于Zheng58（图9C）。然而，作为ZmPAH1直接去磷酸化产物的DG，在ZmHsf17过表达系中与Zheng58相比显著降低（图9C）。
玉米中的ZmHsf17具有关键的应激响应功能域，并与自身和其他玉米HsfA2成员相互作用，其表达在热应激下显著上调。过表达ZmHsf17的玉米增强了热耐受性，表现为改善的生长、光合作用和膜完整性。整合ChIP-seq和RNA-seq分析表明，ZmHsf17直接调控脂质代谢中的基因，如ZmPAH1。脂质组学研究表明，在ZmHsf17过表达系中，关键脂质的水平在热应激下增加，表明其调节脂质代谢途径以增强热耐受性中的作用。
项目咨询
精选合集，欢迎收藏哟！
