温度在决定植物发育速度方面起着至关重要的作用。鉴于当前气候变化的形势，气温的升高可以加速作物的开花并缩短发育阶段。这可能导致农业产量显著减少，引发广泛的粮食安全风险。因此，提高作物的生产力、开发更有效利用资源并增强对不可预测气候事件抵抗力的作物品种变得迫切需要。2024年6月28日，北京市农林科学院蔬菜所白菜课题组在Nature Communications发表了题为“Temperature-Dependent Jumonji Demethylase Modulates Flowering Time by Targeting H3K36me2/3 in Brassica rapa”的研究论文，文章系统解析了组蛋白去甲基化酶BrJMJ18在高温胁迫下稳定白菜类作物花期的分子机理。爱基百客为本文提供了ChIP-seq技术支持。全球变暖对作物的开花时间和产量有严重影响。组蛋白修饰在使植物在环境温度中具有可塑性方面的作用已被充分证明。然而，调节组蛋白修饰及其在栖息地适应中的作用因素仍然难以捉摸。![]()
1. 小白菜亚种的菜心变种（parachinensis, Par）的物种驯化模式
本研究使用的种质收集包括一组新的169份材料和一组先前的41份subsp. rapifera种质。研究者对新组中的169份植物材料进行了基因组测序，从而得到了来自全球各地的六个甘蓝型油菜（Brassica rapa）形态型的210个品种的测序数据集，包括15个subsp. oleifera (Ole)、51个subsp. rapifera (Raf)、9个subsp. chinensis var.narinosa (Nar)、50个subsp. chinensis (Pak-Choi, PC)、41个subsp. chinensis DG(Dark Green, DG)和44个subsp. chinensis var.parachinensis (Par)。使用甘蓝型油菜基因组v3.0作为参考基因组，总共获得了2,690,680个高质量SNPs和210,664个InDels变异（见表1）。表1.210个甘蓝型油菜(B.rapa)品系中遗传变异的一般信息
然后通过遗传分析确定了210个品种的系统发育关系，通过使用STRUCTURE软件分析了这些品种的遗传结构，并发现了七个不同的遗传簇（Fig.1a）。在这些遗传簇中，Par群体被定位在与古老的Raf群体最远的位置，而PC群体则最接近进化树的根部，DG群体则处于Par和PC之间的中间位置。通过主成分分析（PCA）和∂a∂i分析，研究人员揭示了Par群体的进化历史，估计了一个共同祖先的分裂和随后的群体分化时间（Fig.1b）。此外，通过对三个群体的基因流动评估和核苷酸多样性差异的数据进一步揭示了DG群体在Par群体进化过程中的过渡特征（Fig.1c）。在表型分析方面，三个群体之间的开花时间差异很大（Fig.1d）。Par是唯一一个不需要春化就能开花的亚种；然而，DG的三个品种仍然可以在没有经历寒冷的条件下开花，这表明一些早开的遗传组分已经开始在DG的选择中沉积（Fig.1d，左图）。然后，对三个亚种进行了为期4周的春化处理，以确定开花时间的变化。发现PC表现出最长的抽薹期，Par开花期最早，而DG介于两者之间（Fig.1d，右图）。在其他形态特征方面，三个亚种在幼苗阶段彼此相似；而在成年阶段，它们则相互相似。![]()
Fig.1 小白菜亚种的菜心变种（parachinensis, Par）的物种形成逐步模型
2. 全基因组模式分析和QTL 定位确定 B. rapa.Par 驯化的遗传基础
将Par的物种形成分为两个阶段：DG/PC（从PC到DG）和Par/DG（从DG到Par），三个群体的核苷酸多样性（PI）水平相近，表明在选择过程中存在非常微弱的瓶颈效应。在第二阶段，由于DG和Par之间开花时间的显著变化但PI值较低，推测在Par的物种形成中进行了温和但精确的选择。通过分析Par在两个驯化阶段的选择性基因组区域，发现在从PC到DG的第一阶段和从DG到Par的第二阶段中，分别有85个和51个基因组区域受到选择，涉及的基因在花过渡期间表现出差异表达，且第二阶段的选择更为精确（Fig.2a,b）。与开花时间和温度响应相关的基因在Par的驯化选择中富集，且初步表型确认Par表现出较高的热耐受性和对环境变化的开花时间不敏感性。研究者通过比较Par与DG的基因组，识别出24个特定位点和964个候选基因，其中包括373个差异表达基因。进一步通过对Par×PC F2群体的表型分析和BSA-seq定位，鉴定出13个仅响应高温的QTL，为理解Par驯化过程中的遗传基础提供了重要信息。
3. BrJMJ18是Par中一个调控耐热性QTL的候选基因
研究者专注于A09染色体上的一个选择性扫描区域（gQTLA09-1），因为它不与已知的开花时间QTLs共定位，并且与一个热响应QTL区域重叠（Fig.2a-2d）。在这个gQTLA09-1区域共定位了77个基因，其中18个在开花期间有表达，包括8个差异表达基因。特别地，BrJMJ18在DG和Par中表达不同，但在PC中没有差异。因此，研究者提出BrJMJ18作为在gQTLA09-1中对Par物种形成贡献最大的候选基因。通过分析58个PC、41个DG和44个Par种质的基因组，发现BrJMJ18位点在Par和DG之间核苷酸多样性有显著降低，而在DG和PC之间没有（Fig.2d）。BrJMJ18位于Par/DG的连锁不平衡区，对PC、DG和Par中的BrJMJ18进行了单倍型分析，发现了总共71个DNA多态性。因BrJMJ18表达模式差异不显著，研究者使用了6个非同义SNPs类，导致6个氨基酸替换，进行单倍型分类（Fig.2e）。总共135个基因型中有126个被归为两个主要的单倍型组：BrJMJ18PC和BrJMJ18Par（BrJMJ18PC 是PC和DG中的主要单倍型，BrJMJ18Par主要存在于Par中）（Fig.2f）。BrJMJ18Par 在PC中频率低，在DG中增加，在Par中最高（Fig.2f），且在古老群体中分别均匀分布，表明BrJMJ18Par变异对早期B.rapa物种形成不重要，但对后续有优势。![]()
Fig.2 小白菜亚种的菜心变种（parachinensis, Par）驯化的遗传基础
4. BRJMJ18Par-OX植株在温室和田间高温条件下都延迟开花
在自然的DG和Par群体以及Par×PC的F2群体中，分别在正常条件（NC）和高温条件（HT）下初步确认高温对携带BrJMJ18PC的植株开花影响比携带 BrJMJ18Par的植株更强。将BrJMJ18PC和BrJMJ18Par转入到Par中构建过表达植株（-OX），在温室中对BrJMJ18PC-OX和BrJMJ18Par-OX的植株进行分析（Fig.3）。在NC条件下，BrJMJ18PC-OX和BrJMJ18Par-OX植株比Par对照植株更早抽薹（Fig.3a,c）。而在HT条件下，高温显著延迟了BrJMJ18Par-OX植株的抽薹，但对BrJMJ18PCr-OX植株的抽薹没有影响（Fig.3b,c）。为了进一步表征BrJMJ18Par，使用了CRISPR/Cas9构建了Par植株中BrJMJ18的敲除系BrJMJ18Par-CR。在NC和HT条件下，BrJMJ18Par的敲除都导致开花延迟，且HT条件下引起的开花时间延迟更为显著（Fig.3e-h）。在拟南芥中，BrJMJ18Par-OX植株在HT条件下开花比BrJMJ18PC-OX植株晚，进一步证实了BrJMJ18在调控开花时间和耐热性中的作用。在模拟极端高温条件下的隧道温室实验中，BrJMJ18Par过表达植株比对照组晚开花（Fig.3i-j），并且展现出比其他植株更优越的商品质量（Fig.3i）。这些结果表明，BrJMJ18的两个等位基因在NC条件下都能促进开花，但BrJMJ18Par在HT条件下进化出了延迟开花的功能，且BrJMJ18Par的功能表现出温度依赖性，可能在高温下被失活。![]()
Fig.3 在温室和田间高温条件下BrJMJ18转基因Par植株的开花特征
5. BrJMJ18是一种组蛋白H3K36去甲基化酶
BrJMJ18是一种与拟南芥AtJMJ18高度同源(87%)的H3K4me3/2去甲基化酶家族成员。研究者利用亲和纯化的His-BrJMJ18PC/Par蛋白和含有特定修饰的合成组蛋白H3肽段（包括H3K4me3、H3K9me3、H3K27me3和H3K36me2/3）进行去甲基化活性测定。实验显示BrJMJ18蛋白能够特异性地对H3K36me2/3肽段进行去甲基化，而不影响其他组蛋白修饰（Fig.4a）。进一步地，研究者从转基因拟南芥系（AtJMJ18::BrJMJ18orf-GFP）中免疫亲和纯化了两种等位基因的BrJMJ18-GFP蛋白，并进行了体外去甲基化分析。两种等位基因的BrJMJ18-GFP蛋白都能去甲基化H3K36me3和H3K36me2，但对H3K4me3/2、H3K9me3/2和H3K27me3/2没有去甲基化作用（Fig.4b）。最后，为了确认BrJMJ18PC和BrJMJ18Par在体内是否具有这种去甲基化活性，研究者在烟草叶中瞬时表达了BrJMJ18PC和BrJMJ18Par蛋白（35S::BrJMJ18orf-GFP）。结果显示，在NC条件下，BrJMJ18PC和BrJMJ18Par过表达的烟草叶中H3K36me3/2经历了显著的全局降低；同时，HT条件下BrJMJ18PC-OX比BrJMJ18Par-OX叶中的H3K36me3/2降低更为强烈（Fig.4c）。使用BrJMJ18Par-CR植株进行进一步分析，观察到BrJMJ18Par-CR植株中H3K36me3/2的信号显著增加（Fig.4d）。核定位是Jumonji蛋白发挥其功能的必要条件。两种等位基因的BrJMJ18蛋白在瞬时表达的烟草叶中都定位于细胞核（Fig.4e,f）。此外，研究者发现BrJMJ18PC或BrJMJ18Par的核定位不受高温影响（Fig.4e,f）。综上，BrJMJ18是一种在不同温度下的核H3K36me3/2去甲基化酶；然而，在表达BrJMJ18的植株中，高温增强了BrJMJ18PC植株的酶活。Fig.4 BrJMJ18 是一种组蛋白H3K36me2/3去甲基化酶
6. BrJMJ18Par过表达改变了BrFLC3的表达并调节开花
在NC条件下对Par植物使用BrJMJ18的多克隆抗体进行ChIP-seq实验，确定了6456个候选的下游靶基因,其中包括调节花期的BrFLC家族，包括BrFLC1-3。进一步的ChIP-QPCR实验表明，BrJMJ18PC在DG（携带BrJMJ18PC）植株中强烈结合BrFLC1-3，且高温加剧了这种结合；而在Par（携带BrJMJ18Par）植株中，BrJMJ18Par仅与BrFLC3强烈结合，且高温条件下这种结合被解除（Fig.5a）。类似的结果也出现在BrJMJ18Par/PC的过表达植株中。RT-PCR定量结果显示BrFLC3是在Par中花期转变过程中唯一下调的BrFLC基因（Fig.5b）。在NC条件下，BrFLC3在BrJMJ18PC-OX和BrJMJ18Par-OX植株中的表达显著下降；而在HT下，它在BrJMJ18PC-OX中表达下降但在BrJMJ18Par-OX中表达上升（Fig.5c），这与它们在高温下的开花时间变化一致（Fig.3b,c）。在拟南芥中，转基因植物中AtFLC也观察到了类似的结果。通过ChIP-QPCR检测BrFLC3位点的H3K36me3水平，在HT条件下BrFLC3位点的H3K36me3水平在DG中下调，但在Par中上调，这与BrJMJ18PC-OX和BrJMJ18Par-OX植株中BrFLC3的H3K36me3富集一致（Fig.5d,e）。综上，在BrJMJ18Par-OX植株高温下延迟开花主要是由于BrJMJ18Par从BrFLC3解离，导致无法抑制其表达；而BrFLC3在WT Par植物中的效果则不那么直接。![]()
Fig.5 BrJMJ18Par过表达通过改变BrFLC3的表达来调节开花
7. BrJMJ18Par过表达可影响温室和田间高温条件下植物的生长
对BrJMJ18两种等位基因过表达的转基因Par植物在温室和田间条件下进行评估。在温室中，NC条件下，BrJMJ18Par-OX和BrJMJ18PC-OX以及BrJMJ18Par-CR植株与Par对照相比，地上部生物量（鲜重）和叶片数量没有或略有下降；在HT条件下，仅BrJMJ18Par-OX的生物量和叶片数量增加，且比其他植株有更少的老化叶片（Fig.6a）。在田间，BrJMJ18Par-OX植株的产量与Par相当，但高于BrJMJ18Par-CR和BrJMJ18PC-OX（Fig.6b）。另外在植物适当的采摘阶段收获，BrJMJ18Par-OX系的产量远高于其他植株（Fig.6c）。有趣的是，尽管BrJMJ18Par-CR植株表现出与BrJMJ18Par-OX植株类似的延迟开花表型，但在高温下并没有表现出地上部生物量和叶片数量的增加（Fig.6）。这表明BrJMJ18Par-OX在高温下可能获得了新的功能以介导植物生长，而不仅仅是BrJMJ18Par失活的结果。Fig.6 在温室和田间高温条件下BrJMJ18Par的过表达可以介导植物生长
8. BrJMJ18Par调节高温下的叶绿素生物合成
基于BrJMJ18Par-OX和BrJMJ18PC-OX植株在表型上的差异，分别对在NC和HT下生长的BrJMJ18Par-OX、BrJMJ18PC-OX植株和Par植株进行ChIP-seq分析，同时进行RNA-seq实验，以全面探索它们的功能差异。ChIP-seq结果显示，在NC下，BrJMJ18PC和BrJMJ18Par分别富集到2056和2018个基因，而在HT下分别是535和382个基因，表明高温阻碍了两种等位基因的结合活性，且 BrJMJ18Par受影响更大。BrJMJ18PC-OX中富集的基因有32.8%与H3K36me3靶向基因重叠，BrJMJ18Par-OX中有28.6%；而在HT下，该比例分别下降到22.1%和20.0%（Fig.7a,b）。在NC下，71.7%和71.2%的富集基因分别特异于BrJMJ18PC-OX和BrJMJ18Par-OX植株，而在HT下对应的比例增加到82.9%和76.2%（Fig.7a,b）。GO富集分析显示，在NC下，BrJMJ18PC和BrJMJ18Par的GO terms无明显区别；在HT条件下，BrJMJ18PC富集于微观细胞结构，而BrJMJ18Par富集于大分子代谢相关。RNA-seq结果显示，在NC条件下，BrJMJ18PC-OX和BrJMJ18Par-OX分别鉴定出5025和4358个差异表达基因（DEGs）；在HT下，分别为1457和2019个，超过三分之一的DEGs与Yue等人报道的热响应基因重叠。在NC下，BrJMJ18PC-OX和BrJMJ18Par-OX植物中的DEGs分别有40.5%和45.6%与H3K36me3靶向基因重叠，而在HT下这一比例分别下降到31.2%和27.9%。此外，NC下18.2%和17.8%的DEGs分别是BrJMJ18靶向基因，而在HT下这一比例分别下降到5.0%和5.7%。NC下44.8%和36.3%的DEGs分别特异于BrJMJ18PC-OX和BrJMJ18Par-OX植物，而在HT下这一比例分别增加到71.0%和79.1%，进一步表明BrJMJ18PC和BrJMJ18Par在HT下的功能分化（Fig.7c,d）。GO富集分析显示，在NC下，DEGs富集到的GO terms基本一致；在HT条件下，BrJMJ18Par-OX植物中上调的DEGs主要与细胞分裂相关，而BrJMJ18PC-OX植物中下调的DEGs显示出在细胞分裂相关GO terms中的富集。BrJMJ18Par-OX植物中下调的DEGs在叶绿素和四吡咯生物合成、辅因子代谢过程和叶绿素生物合成过程等过程中特别富集（Fig.7e,f）。对六个与叶绿素生物合成和碳代谢相关的热响应基因进行了qPCR分析。与对照Par相比，所有六个基因在HT下在BrJMJ18PC-OX植物中略有诱导，而在BrJMJ18Par-OX植物中显著下调（Fig.7g）。这些发现表明，在高温下BrJMJ18PC和BrJMJ18Par之间存在显著的功能差异，BrJMJ18Par在调节叶绿素生物合成和植物生长方面表现出更大的效力。![]()
Fig.7 RNA-seq和ChIP-seq数据综合分析揭示了BrJMJ18Par调节高温下叶绿素的生物合成
9. T345A、Y633C和L654F氨基酸突变导致BrJMJ18Par/PC的功能差异
与BrJMJ18PC相比，BrJMJ18Par在HT下显示出降低的结合和催化活性（Fig.4-7）。BrJMJ18包含五个不同的功能域：JmjN、JmjC、Zf-C5HC2、FYRN和FYRC（Fig.2f）。在所有六个氨基酸突变中，T345A发生在已知的催化JmjC域，Y633C和L654F都位于DNA结合的Zf-C5HC2域和FYRN域之间的间隙，这在染色质相关蛋白中很常见。因此，推测BrJMJ18PC和BrJMJ18Par的功能多样性体现在T345A、Y633C和L654F的突变上。然后在烟草叶片中瞬时表达了BrJMJ18PC、BrJMJ18Par和BrJMJ18Par（A345T）、BrJMJ18Par(C633Y)、BrJMJ18Par(F654L)和BrJMJ18Par(C633Y)/(F654L)的变体蛋白，以探究它们的催化功能。结果显示，在NC条件下，BrJMJ18Par(A345T)和BrJMJ18Par(C633Y)的去甲基化酶活性高于BrJMJ18PC，而BrJMJ18Par(F654L)和BrJMJ18Par(C633Y)/(F654L)表现出较低的活性（Fig.8）。然而，在HT条件下，BrJMJ18Par(A345T)和BrJMJ18Par(C633Y)/(F654L)显示出与BrJMJ18PC相似的H3K36me3/2去甲基化活性，但高于BrJMJ18Par（Fig.8）。这些发现表明，突变T345A、Y633C和L654F促成了BrJMJ18PC和BrJMJ18Par之间的催化差异。![]()
Fig.8 T345A、Y633C和L654F三个氨基酸突变导致了 BrJMJ18Par /PC之间的催化差异本文通过全基因组模式分析、QTL定位、过表达和CRISPR/Cas9突变体分析、ChIP-seq和RNA-seq数据分析，揭示了BrJMJ18作为一个温度依赖性的H3K36me2/3去甲基化酶，在高温条件下通过调控BrFLC3的表达来延迟开花时间，从而增强B. rapa的耐热性。本文的研究为理解植物在环境温度变化中的适应性提供了新的视角，并为培育耐热作物提供了重要的基因资源。
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