光解酶/隐花色素蛋白属于类黄酮蛋白超家族，在蓝光照射下分别作为光酶/光受体发挥作用。这两类光蛋白在序列和结构上高度相似，但在不同生物体内发挥着完全不同的功能。光解酶（PLs）利用蓝光能量修复紫外线诱导的DNA损伤，包括环丁烯嘧啶二聚体（CPD）和嘧啶（6-4）嘧啶酮光产物（6-4PP）。隐花色素（CRYs）则参与多种蓝光调控机制，如植物的光周期开花和动物的昼夜节律。最近，有几种蛋白质被认为具备双重功能，既参与DNA修复，又参与信号转导。其中一种双功能蛋白质是来自绿藻Chlamydomonas reinhardtii（CraCRY）的动物样隐花色素（aCRY），该蛋白在蓝光激发下显示出同时具备修复6-4PP和信号传导的特性。然而，其双重功能的分子机制仍然不清楚。在该研究中，作者聚焦于其修复动力学，旨在阐明其分子机制和催化光周期，绘制修复过程的动态演变。
最近，CraCRY的复杂结构已通过X射线晶体学被解析，包含其辅因子FAD和底物6-4PP，但缺少无序的C末端扩展区。该扩展区包含大约100个氨基酸，主要负责信号转导功能。在这里，6-4PP的修复仅发生在光解酶同源区域的活性位点，即使没有C末端扩展区。在活性位点，晶体结构显示有两个保守的组氨酸残基H357和H361，它们分别对应于拟南芥6-4PL中的H364和H368，围绕着底物6-4PP。拟南芥6-4PL是目前唯一已解析其修复动力学的6-4PL；其修复反应的反应机制也在图1中展示。作者观察到，在拟南芥6-4PL中，第一组氨酸H364作为关键的质子供体在修复过程中起着至关重要的作用。在CraCRY中，第二组氨酸H361而非H357与6-4PP的5′侧羟基的氧原子相距仅3.2 Å，因此可能作为质子供体。通过定点突变，作者制备了两个单一突变体H357A和H361A，以及一个双突变体H357F/H361F，旨在确定这两个组氨酸在修复反应中的作用。
首先，作者进行了滴定实验以获得CraCRY与包含6-4PP的8-mer单链DNA复合物的解离常数（Kd），并测量其修复量子产率（QY）。获得的野生型（WT）解离常数为7.01 × 10^−6 M，表明其具有较强的结合作用。以大肠杆菌光解酶修复（EcPL）为对照，作者测量了CraCRY的修复量子产率，即在266 nm处修复的胸腺嘧啶吸收的增加和325 nm处6-4PP吸收的减少。修复量子产率在水中为(6.6 ± 0.04)% ，在重水中为(3.7 ± 0.03)%，均低于拟南芥6-4PL。令人惊讶的是，H357A和H361A的突变几乎没有修复活性，其量子产率分别为0.014%和0.025%。对于双突变H357F/H361F，未观察到任何修复迹象，表明组氨酸残基在修复中必须起作用。为了从最基础的层面理解这些修复过程，作者随后采用飞秒光谱技术，将酶促修复反应分解为一系列基本步骤，并表征其详细的动态过程。作者跟踪修复演化过程，捕捉到重要的中间体，并最终阐明了修复过程的动态图景。
原文链接：
https://doi.org/10.1073/pnas.2417633121
—END—
内容为【iNature】公众号原创，
转载请写明来源于【iNature】
微信加群
iNature汇集了4万名生命科学的研究人员及医生。我们组建了80个综合群（16个PI群及64个博士群），同时更具专业专门组建了相关专业群（植物，免疫，细胞，微生物，基因编辑，神经，化学，物理，心血管，肿瘤等群）。温馨提示：进群请备注一下（格式如学校+专业+姓名，如果是PI/教授，请注明是PI/教授，否则就直接默认为在读博士，谢谢）。可以先加小编微信号（love_iNature），或者是长按二维码，添加小编，之后再进相关的群，非诚勿扰。
投稿、合作、转载授权事宜
请联系微信ID：13701829856 或邮箱：iNature2020@163.com
觉得本文好看，请点这里！
