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今天带来一篇来自山东大学齐鲁医院本月刚发的一篇文章。作者仅用了三个样本，利用空间转录组学研究肝内胆管癌（iCCA）的肿瘤微环境（TME）和肿瘤细胞的空间异质性。而且文章还锁定了靶标蛋白TFF3，为针对该蛋白在iCCA治疗中的潜在应用提供了新的见解。三个样本发9+我不信你们不心动！担心空间转录组数据量大处理不了的宝子，可以考虑小云的服务器，而且现在租就送生信分析学习课程，从此实现自主分析发SCI，感兴趣的速速来call！
题目：空间解析转录组学揭示了肝内胆管癌中癌细胞和肿瘤相关巨噬细胞之间明显的串扰
发表时间：2024.9
多项研究表明，肿瘤相关巨噬细胞(TAM)促进癌症的发生和发展。然而，在肝内胆管癌(iCCA)中，巨噬细胞在肿瘤微环境(TME)中的重编程以及TME与恶性亚克隆之间的串扰尚未得到充分的表征，特别是在空间分辨方面。破译iCCA中可变组织细胞组分的空间结构有助于了解包含病理变化和细胞变异性信息的基因表达的位置背景。
研究结果
iCCA的空间结构景观
作者通过空间转录组学RNA测序（ST）分析iCCA系统。鉴定出5个斑点区，包括恶性区(56.27%，以KRT19为特征)、巨噬区(14.72%，以CD68为特征)、肝细胞区(10.61%，以ALB高表达)、免疫区(9.41%，以CD3D、MS4A1和MZB1高表达)和成纤维细胞/ ecm_区(8.99%，以ACTA2为特征)。
由于单个ST点大约覆盖10个细胞，因此选择了标记为恶性的点，并计算显性TME成分的比例。以巨噬细胞为主的恶性斑点所占比例最高(32.15%)。成纤维细胞为主和免疫细胞为主的斑点分别占10.08%和14.04%。
接下来，使用免疫荧光(mIF)方法证明CD68阳性巨噬细胞在TME中强烈浸润，而CD3D阳性免疫细胞浸润较弱。提示iCCA为巨噬细胞高浸润免疫表型。
患者间和患者内iCCA的分子和空间异质性
作者提取数据中的所有恶性斑点进行进一步分析，以正确捕获每个患者的空间分子谱。恶性斑点可进一步划分为几个亚克隆。每个恶性亚克隆表达不同的癌症相关基因。
从空间上看，恶性亚克隆表现出不同的分布模式，要么像患者1那样扭曲在一起，要么像患者2和3那样受物理接近驱动并被基质区分开，表明恶性肿瘤受周围微环境的影响，具有TME成分的肿瘤细胞形成了截面内的异质性空间结构。
TFFs在iCCA中的空间表达
在作者的数据中，不同的iCCA患者共享一个共同的恶性亚克隆，该亚克隆高度表达TFFs。因此本研究主要关注TFF3的表达。首先使用TFF3抗体进行免疫组化染色，在iCCA队列中检测TFF蛋白表达，证实了与正常胆道相比，TFF3在肿瘤区域的显著分布。
接下来，为了利用ST数据初步探索TFFs在胆管癌恶性演变中的作用，构建了所有恶性斑点的伪时间轨迹，并可视化了沿伪时间变化的基因。在所有3例病例中，TFF的表达在伪时间内持续存在，表明TFF参与了恶性肿瘤的演变。
为了以空间解析的方式获得细胞间通信景观的概述，作者使用了扩展数据库的CellChat_v2工具。对受体-配体相互作用数量和强度的进一步分析显示，巨噬细胞组在数量和强度方面与其他细胞的相互作用最强。无论是作为发送者还是受体，TFF+恶性亚组都比其他恶性亚群表现出更活跃的与巨噬细胞的相互作用。这表明TFF分泌肿瘤细胞与TME中巨噬细胞表型之间存在复杂的潜在串扰机制。
巨噬细胞在iCCA TME中的肿瘤容许激活状态
首先，为了探索iCCA中tam的异质性表型，作者从GSE13870914中获得了iCCA患者的单细胞数据。提取巨噬细胞进行亚聚类。所有巨噬细胞被注释成四个亚群，每个亚群都具有特异性高表达的标记基因。
由于CD163是iCCAs中浸润的巨噬细胞的普遍标记物，其表达表明巨噬细胞极化具有肿瘤允许表型，作者试图在数据中证实其普遍的空间分布。在iCCAs中发现了免疫抑制微环境。接下来，使用SPOTlight工具对空间数据中的巨噬细胞富集点进行反卷积，从单细胞数据中估计每个巨噬细胞亚群的比例。表明显性巨噬细胞亚群为Mac_S100。当通过在显微镜下为每个患者切片选择大约10个视野来量化TFF3和CD163的表达时，进一步观察到CD163和TFF3呈正线性共分布。S100A4和S100A8染色证实了它们在巨噬细胞组中的高表达。然后，应用多重IF染色方法，证实了CD163、S100A4和S100A8在TFF3阳性恶性细胞周围的共定位。
iCCA恶性细胞与巨噬细胞的相互作用
为了验证以上假设，作者培养了人类单核细胞系THP-1和胆管癌细胞系QBC-939和HUCCT1进行体外分析。孵育24小时后，观察到不同的细胞几何形状和巨噬细胞标志物CD68 mRNA表达升高。这表明THP-1细胞的巨噬细胞分化(M0)。然后将QBC-939或HUCCT1细胞上清液与未刺激的M0细胞共培养。48 h后，M0细胞表现出明显的M2极化细长形状。为了确认巨噬细胞的极化状态，通过RT-PCR和Western blotting来评估M2或TAM标记物的表达。发现用胆管癌细胞上清液刺激的巨噬细胞表达高水平的M2标志物，包括CD163、CD206、ARG-1和IL-10。刺激后，它们也上调了S100A4和S100A8在mRNA和蛋白水平上的表达，与ST数据一致。这表明iCCA恶性细胞促进促瘤巨噬细胞重编程。
接下来，为了探究上述表型极化是否部分由TFF蛋白介导，作者设计了两个靶向TFF3的siRNA来减弱其在QBC-939细胞中的表达。TFF3缺失后，M2标记物(CD163、CD206、ARG-1和IL-10)以及S100A4和S100A8的表达显著下调，证实了假设，即iCCA细胞通过分泌TFF蛋白诱导常驻巨噬细胞M2表型和促肿瘤极化。
文章小结
总之，研究提供了iCCA中肿瘤生态系统异质性的证据，包括免疫抑制和肿瘤进展，以及iCCA细胞和TAM之间的串扰。这篇文章仅用了3个样本就发了9+高分，而且获得国自自然科学基金以及省级和市级基因项目支持，属实让人羡慕！有的小伙伴担心这么大的数据量自己处理不了，没关系，小云的服务器可以轻松驾驭，而且现在推出了租赁服务器送生信学习课程活动，想了解的call小云吧~
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