宿主细胞残留蛋白的复杂性
宿主残留蛋白是一群蛋白集合体，种类及杂质中的组成随着产品以及工艺变化而变化，个性化特征明显。在纯化过程中，产品蛋白含量逐步提高，宿主杂质蛋白含量大幅下降。这个过程中总HCP的含量下降，但各种HCP组分并非均等按比例下降，其组成或提高或降低。HCP这一独特的复杂性给HCP 的检测，尤其是ELISA的检测方法带来众多问题和挑战。
图1. HCP随着生物制品纯化过程含量逐渐下降
参考文献：The Future of Host Cell Protein (HCP)Identification During Process Development andManufacturing Linked to a Risk-BasedManagement for Their Control
ELSIA方法检测HCP残留存在的问题
1、报告水平差异难以桥接：
就样本而言，因试剂盒不同，报告水平或高或低；
2、变更方法筛选工作量巨大：
不同试剂盒间的报告差异，或高或低，因管线不同而不同，并不一致，规律不明显，造成变更方法需筛选多种试剂盒；
3、药品生产质量控制标准难以客观执行：
不同试剂盒方法学间对相同药品的残留报告难以客观平行对比评价，造成HCP风险控制标准难以完全客观有效；
4、ELISA方法的含量报告是基于标准品的相对估计值：
在缺少权威统一标准品的情况下，难以客观评价或平行比较药品间的真实杂质水平；
造成的原因
1、上游标准物质与下游药品中HCP杂质组成差异：
药品生产实际工艺中，HCP绝对值下降，但各种HCP杂质因下游纯化工艺的偏好，导致杂质的组成丰度也在发生变化，缺少表征，难以保持与上游收获液中相同的比例关系，因此用上游如收获液杂质做为参考品来估计DS的杂质含量，难以客观准确；
2、工艺差异：
实际管线工艺与商品化试剂盒，甚至基于工艺的空载，空细胞模拟发酵工艺开发的试剂盒都有差异，导致HCP标准品的杂质种类，组成，抗体混合物的组成与对应样本有差异；
3、检测参考品及抗体都是高度复杂混合物：
基于ELISA方法检测HCP，采用了多种抗体混合物来检测，利用特定HCP混合物做为相对估计的参考，导致该方法客观上高度复杂；
4、标准品及抗体无法标准化：
抗体及参考物质无法统一，造成难以横向客观评价药品间真实杂质水平；
5、检测方法差异：
不同试剂盒的检测方法差异，带来不同反应动力学性质，因此不同样本，不同HCP杂质含量或种类，或者不同样本基质，都有可能在不同的检测方法中产生不同的结果；
6、抗体覆盖率及特定抗体效价难以平衡：
单独追求高抗体覆盖率无法兼顾各种抗体实际效价，难以即坚持了覆盖率，又使得所有HCP个体都能达到有效检测灵敏度；
在上述众多问题中，不同ELISA方法之间的报告差异是目前面临的普遍问题，尤其是企业基于供货安全及降本增效等原因需要考察评估不同品牌的ELISA检测方法报告水平差异。但基于HCP本身的复杂性和ELISA方法的属性，报告水平的差异不可避免。
图2. 基于ELISA方法难以弥合不同ELISA方法报告水平差异
工艺差异对于HCP的ELISA检测结果的影响
基于E.coli 表达系统生产的常见的生物制品有重组蛋白和质粒两种类型，其表达和纯化工艺差异较大。其中重组蛋白样本制备过程菌体的裂解主要采用机械破碎等方式的完全裂解工艺，而质粒样本主要采用碱裂解工艺。不同品牌ELISA检测试剂盒因其参考品制备工艺不一样，对样本的检测结果有较大差异。应根据样本的实际工艺选择匹配的试剂盒。
图3. 重组蛋白和质粒产品的制备工艺流程
对于不同项目的四个质粒样本E.coli HCP的检测采用不同品牌的ELISA检测试剂盒，检测结果如表1所示。相比于采用和质粒制备工艺一样的碱裂解工艺E.coli HCP试剂盒的报告数值，全裂解工艺E.coli HCP检测试剂盒的报告值显著偏高。但图4电泳图的结果显示，12ug的质粒的HCP总量理论上小于10ng。这与碱裂解工艺E.coli HCP检测试剂盒的报告值趋势一致，而全裂解工艺E.coli HCP检测试剂盒偏高的报告值与电泳结果不符合。故通过电泳结果对比验证反馈，对于质粒样本采用碱裂解工艺E.coli HCP检测试剂盒的检测值更加合理和可靠。
表1. 不同工艺试剂盒的质粒样本Ecoli HCP 残留报告
a：依科赛E.coli HCP残留检测试剂盒-Plasmid（ELISA法），校准品HCP的制备工艺采用和质粒制备类似的碱裂解工艺；
b：某品牌E.coli HCP检测试剂盒，参考其产品说明书介绍，其校准品HCP制备工艺采用和重组蛋白制备类似的全碱裂解工艺
图4.不同样本的蛋白质电泳图。结果显示12ug的项目A与项目B的质粒样本的HCP含量应小于10ng
检测方法变更选择策略建议
1、相似工艺原则：
选择和实际样本相似工艺开发的方法学工具；
2、有限解读：
方法或试剂盒仅用于去杂质工艺的优化和产品工艺稳定性评价，而不是当成绝对残留水平，避免过度解读；
3、针对性开发：
对药物产品的特殊风险控制建议开发工艺特异性方法进行客观评价；
4、优先选择能在DP或DS供试样品中检出杂质的方法：
至少该方法有能力发现所存在的HCP杂质，优先保证药物产品杂质风险得到识别；
5、候选方法报告水平应不低于原方法检出值：
有利于桥接，或下一步改良工艺，提高药品质量；
6、候选方法应能反应纯化工艺对杂质HCP去除的效率，但不追求必须与前值一致：
虽然会遇到与原方法检出的杂质去除效率不一致，或高或低，但是不建议过度追求保持杂质HCP去除效率一致，因为不同方法对不同HCP检出效率不完全一致。纯化工艺虽然在绝对值上有效降低了HCP总量，但是可能因不同工艺对不同HCP杂质去除效率不一，比如：离子交换可能导致与药物分子具有相同电荷性质的杂质HCP得到相对富集。而不同方法对这类特定HCP杂质的检出能力不同，而导致出现不同的HCP杂质清除效率。
针对目前宿主细胞残留蛋白ELISA检测方法存在的问题，依科赛自主研发支持申报的高覆盖HCP检测试剂盒，包含ResiQuant®CHO宿主蛋白残留检测试剂盒、ResiQuant®E.coli宿主蛋白残留检测试剂盒、ResiQuant®293宿主蛋白残留检测试剂盒。试剂盒均经过完整的方法学验证符合申报要求，目前已经支持多家生物制药企业IND申报成功。
HCP检测产品信息
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参考文献：
U.S. Pharmacopeia <1132> Residual host cell protein measurement in biopharmaceuticals.
European Pharmacopoeia Monograph 2.6.34. Host-cell protein assays.
ICH Q6B Specifications: test procedures and acceptance criteria for biotechnological/biological products.
