甘露糖赤藓糖脂的上游生产和下游纯化

摘要：生物表面活性剂是具有显著表面活性特性的天然化合物，可能为传统表面活性剂提供一种环保的替代品。其中，甘露糖赤藓糖脂（MELs）作为一种糖脂生物表面活性剂，特别引人注目。MELs已在多个领域用于各种应用，并目前已商业化生产。在工业上，它们被用于制药、化妆品、食品和农业行业，基于它们降低表面张力和增强乳化的能力。然而，尽管它们具有实用性，但其工业生产相对有限。从生物加工的角度来看，提高生产过程的两个感兴趣的领域是上游生产和下游（分离和纯化）产品回收。前者已经进行了大量研究，研究人员调查了多个生产因素：使用的微生物种类或菌株、生产介质的组成以及实施的生产策略。改进和优化这些是扩大MELs生产的关键。另一方面，后者在文献中相对较少的工作被提出。在大多数情况下，已经采用了传统的分离技术。这篇系统综述通过全面分析当前关于MELs的生产、分离和纯化的最新技术，介绍了研究人员使用的生产工艺和纯化方法。通过这样做，综述提出了不同可能的方法，并强调了一些潜在的未来工作领域，通过确定MELs商业化的机会。

引言

表面活性剂是具有两亲性的分子，在各种科学和工业领域都有应用。这些多功能分子能够通过在不混溶相之间的界面积累来减少表面和界面张力。这创造了稳定的乳液，可以促进不混溶相的混合。因此，它们已被广泛应用于日常产品中，如洗涤剂、织物柔软剂、润湿剂、提高石油回收率的增强剂和倾点降低剂。此外，它们的分子间相互作用也使得在生物医学应用中有了多种用途，如药物制剂和药物输送系统。这与全球表面活性剂市场规模的稳步增长相对应，如图1a所示。

图1 (a) 估计的全球表面活性剂市场总规模。(b) 各种行业当前生物表面活性剂市场份额。

表面活性剂现在构成了全球制造的最大类别的合成化学品之一，预计到2030年全球市场规模将增至817亿美元。可以考虑两类主要的表面活性剂，即化学和天然表面活性剂。这些表面活性剂在它们的来源和性质上有所不同。例如，化学表面活性剂被称为合成表面活性剂，因为它们是在化学过程中从非可再生资源人工合成的。这允许精确控制它们的结构和性质。另一方面，微生物生物表面活性剂是由包括细菌、真菌和酵母的各种菌株的多种微生物种类生产的。还有一类生物表面活性剂是从生物材料（如皂苷）生产的。与合成化学品相比，微生物生物表面活性剂可能更具环境友好性、生物相容性和生物可降解性。因此，在过去二十年中，由于它们可以从可再生资源中生产，并且可能具有有用的性质，对生物表面活性剂的生产和应用的研究重点显著增加。专注于生物表面活性剂，已经鉴定出不同的类别，主要根据它们的亲水头基团的结构进行分类。这包括低分子量（磷脂、糖脂、脂肽）以及高分子量（聚合物和颗粒）生物表面活性剂。糖脂因其特殊性质和高产量而特别受到关注。在这个类别中，甘露糖赤藓糖脂（MELs）是一个特别感兴趣的生物表面活性剂。由于它们在生物医学和化妆品工业中的应用性，MELs引起了兴趣。

MELs在生物医学和化妆品行业的使用可以归因于它们作为干燥和受损皮肤的保湿剂的潜在应用。此外，MELs在人类头发发展方面表现出显著的保护和修复活性。由于这些应用，研究已经转向理解MELs的生产和纯化。这篇综述旨在汇集和总结有关MEL生产和纯化的相关工作。

这篇综述的第一部分深入探讨了当前针对MELs上游生产的研究成果。如图2所示，最近的研究主要集中在MELs的上游生产。本节涵盖了使用各种微生物菌株生产MELs，同时探索影响生产的主要因素。为了理解这些过程的工业可扩展性，本文对从摇瓶到生物反应器的MEL生产放大研究进行了批判性回顾。还讨论了这些过程可扩展性的限制。最后，本节接着讨论了从各种工业废物流中生产MELs作为实现循环经济的途径。

尽管上游生产至关重要，但需要进行大量的下游处理才能生产出纯化的MEL产品，如果特定应用需要纯化产品的话。因此，这篇综述的第二部分专注于MELs的下游处理——回收和纯化。如图2所示，有限的研究集中在改进MELs的下游处理（只有大约17%的审查论文）。因此，MELs的有效分离和纯化仍然是限制MELs生产规模化的重大挑战。本综述评估了MELs下游处理的现状，试图突出与MELs纯化相关的最重大挑战。这将有助于通过在前景展望部分提出的挑战和机遇，确定未来研究的明确重点。

图2 (a) 2010年至2022年间发表的与MEL相关的研究研究的重点。(b) 2010年至2022年间发表的研究文章中，关注上游或下游工艺开发的比例。这些数据是通过在主要研究数据库上进行Scopus搜索获得的。MEL，甘露糖赤藓糖脂。

图3 根据它们的分子量和亲水头基团的结构对微生物表面活性剂进行分类

2. 微生物生物表面活性剂

生物表面活性剂被定义为生物来源的表面活性化合物，更具体地说，本文将考虑由各种微生物菌株生产的微生物生物表面活性剂。这些化合物作为次级代谢产物由各种细菌、真菌和酵母产生，有些也可以从植物或动物中产生。已经定义了五大类生物表面活性剂，如图3所示，并基于化合物中发现的亲水头基团的结构。虽然这些主要分类很有用，但生物表面活性剂结构还有额外的复杂性——特别是，疏水脂肪酸尾部可以是可变的，产生一组同系物：结构相似的生物表面活性剂，具有略有不同的性质。此外，当亲水头基团的糖部分有轻微的结构变化时，还会出现额外的同系物——例如，在MELs的情况下，乙酰化的程度和位置。尽管存在这些结构复杂性，生物表面活性剂已在许多产品中找到了应用。在这五大类中，糖脂是使用最广泛的类别之一。糖脂由一个亲水的碳水化合物部分共价结合到一个疏水的脂质残基上。它们以相对较高的产量和有用的性质脱颖而出。MELs是一种糖脂生物表面活性剂，由于它们理想的表面活性和润湿性质，使它们非常适合各种生物医学和化妆品应用。

2.1. MELs

2.1.1. MELs的结构

(1).用于分析MELs结构的分析技术

多年来，已经采用了各种分析技术来确定不同微生物在不同操作条件下生产的MELs的结构变体。例如，核磁共振（NMR）用于确定化合物的分子结构。使用这种技术，纯化的MEL提取物溶解在二甲基亚砜-d6中，并记录1H NMR和13C NMR谱。同样，LC-MS分析通常用于确定已识别的各种结构变体的分子量。最后，GC-MS分析通常用于分析这些化合物的脂肪酸组成。在进行GC-MS分析以获得脂肪酸剖面之前，提取的化合物通过碱法甲酯化，以合成甲基酯衍生物，如Fan等人所述。

MELs的结构多样性使用前一节中描述的技术，已经鉴定出四种天然存在的MELs结构变体（A、B、C和D）。这些变体都包含一个亲水的4-O-β-D-甘露吡喃糖基-赤藓糖核心，根据在甘露糖的C4和C6位置发生的乙酰化模式进行区分。MEL-A代表化合物的二酰化形式，而MEL-B和-C分别在C4和C6位置单酰化。最后，MEL-D代表化合物的完全脱酰化结构。

此外，可变的疏水脂肪酸链共价结合到亲水的糖核心上。二酰化的MELs，在化合物核心的甘露糖的C2和C3位置含有两条脂肪酸链，是MELs最常见的天然产生的结构变体，然而，已经观察到单酰化和三酰化MELs的生产。这些不同的结构变体由不同的微生物以不同的量产生。然而，MEL生产期间使用的碳源显著影响化合物中发现的脂肪酸链的饱和度。表1总结了基于微生物种类、碳源和产生的MEL变体的脂肪酸剖面差异，如文献中所报告。

2.1.2. MELs的性质和应用

MELs具有引人注目的表面活性特性，包括乳化、分散、增溶、起泡、渗透和润湿效果。此外，它们还具有有趣的液晶形成和保湿性质。这些性质使得它们在各种生物医学和化妆品应用中得以应用。MELs已被证明对干性或受损皮肤和头发的治疗有效。Yamamoto等人观察到MELs对十二烷基硫酸钠损伤的皮肤细胞显示出高恢复率（>80%），与已知的皮肤保湿剂天然神经酰胺相当。Takahashi等人观察到MEL-C对氧化应激的保护活性高于已知的抗应激和抗衰老活性物质熊果苷。这些类神经酰胺的特性也证明了MELs在头发护理领域的适用性。

MELs另一个有趣的特性是它们作为抗菌剂的潜力，这是由于它们对某些革兰氏阳性细菌和真菌的抗菌活性而产生的。Shu等人观察到MELs通过破坏双层细胞膜抑制了革兰氏阳性细菌B. cereus的增殖。MELs对这些微生物的最小抑制浓度和最小杀菌浓度分别为1.25和2.5 mg/mL。此外，MELs对其他食源性和植物病原体也显示出类似的抗菌活性。这些结果表明，MELs有潜力作为食品保鲜和农业中的绿色农药的抗菌剂。

3. MELs的生产

这一部分详细说明了文献中用于生产MELs的方法。许多文献都是基于摇瓶中的小规模实验，考虑到培养基的组成和条件（碳源、氮源、微量元素、pH值、温度、充氧和搅拌）。小规模实验的一些细节可以用来指导较大体积发酵，这在第3.2节中讨论。正如所强调的，MEL生产中的一个重大开支是碳源，因此许多研究人员已经研究了使用低价值或废物流作为底物；这在第3.3节中讨论。最后，第3.4节考虑了如何在发酵后改变生产的MEL的结构，以生产具有不同特性的不同结构的MELs。

(1). 摇瓶实验

摇瓶实验是微生物发酵研究中常用的初步方法，用于筛选菌株、优化培养基成分和发酵条件。这些条件包括碳源、氮源、微量元素、pH值、温度、充氧和搅拌速度，它们对MELs的产量和组成都有显著影响。

(2). 放大培养

从小规模摇瓶实验中获得的知识可以用于指导较大体积的发酵过程，这可能涉及到生物反应器的使用。放大培养需要考虑氧气传递、热量去除和混合效率等因素，这些都可能影响微生物的生长和MELs的产生。

(3). 碳源的选择

碳源是MELs生产中的主要成本之一。为了降低成本，研究人员探索了使用低价值的碳源或工业废物流作为底物的可能性。这些废物流可能包括农业废弃物、食品工业副产品或其他有机废物。

(4). MELs的结构调整

发酵过程结束后，可以通过化学或酶催化的方法对MELs进行结构调整，以产生具有不同特性的MELs变体。这种结构调整可以改变MELs的物理化学性质，从而拓宽其应用范围。

表1 不同微生物生产的甘露糖赤藓糖脂的类型和特性

3.1. 微生物生产MELs

3.1.1. 影响微生物MEL生产的因子

MEL相关研究的第一阶段旨在鉴定生产MEL的微生物。因此，已经确定MELs是由属于Pseudozyma和Candida属的担子酵母以及属于Ustilago和Sporisorium属的黑粉菌产生的，如表1所示。由于不同的生产生物可用于MELs，不同的因子已被证明影响各自生产物种的产量。碳源 已经研究了各种碳源用于MELs的生产，如表2总结。从表中可以看出，疏水性碳源（如植物油）已被广泛使用，因为它们为生物体提供了脂质（MELs的关键部分）的来源。这在1990年首次被研究，研究了各种植物油生产P. antarctica T-34 MELs的效率。虽然大多数植物油是生产MELs的良好碳源，但大豆油导致报告的MEL滴度高达到40 g/L。在那项工作之后，使用不同的Pseudozyma属菌株和疏水性碳源（大豆油或橄榄油）获得了更高的MEL浓度（100 g/L），如表2所示。这些滴度的差异可能归因于不同的物种和菌株，以及碳源和喂养策略。

(1).氮源

Hewald等人对Ustilago maydis生产MELs的生物合成途径中涉及的基因进行了分析。尽管生物体在没有氮的情况下生长效果不佳，但观察到在氮限制下，所有菌株生产MELs所必需的糖基转移酶（EMT1）的表达增强。这些结果表明，氮的存在是微生物生长所必需的。相反，其缺乏是生产MELs所必需的。已经使用了各种氮源用于MEL生产微生物的生长，如表2所示。在研究了多种不同氮源对P. antarctica T-34生长和随后MELs生产的效率后，Kitamoto, Akiba等人得出结论，2 g/L的NaNO3在微生物生长方面表现最佳。这导致最高产品浓度为40 g/L。确定铵盐是较不适合的氮源，因为它们的消耗降低了培养基的pH值，抑制了该菌株生产MELs。这些结果导致了NaNO3作为MEL生产微生物生长的氮源的广泛使用。

(2).微量元素

由于微量元素在激活微生物代谢合成中涉及的酶的重要作用，可以推断微量元素是影响MELs生产的一个重要因素。正如Kitamoto, Akiba等人报告的，通过添加1 g/L酵母提取物作为矿物质和微量元素的来源，P. antarctica T-34的MELs生产得到了改善。因此，酵母提取物一直被持续补充到MEL生产培养基中，在所有随后的出版物中，很少有研究旨在了解单个微量元素对MEL生产的影响。Yang等人进行了唯一一项关于单个微量元素对MELs生产影响的研究。在研究中，不同的微量元素，包括Fe2+、Fe3+、Ca2+、Mn2+和Cr2+，以0.1 mM的浓度单独添加到P. aphidis DSM 70725培养基的底物中。观察到通过向生产介质中添加Fe2+和Fe3+可以增强MEL生产，而这种菌株在Ca2+、Mn2+和Cr2+存在下MEL生产受到抑制。这些结果表明微量元素对MEL生产的重要影响，并支持对这个话题进行进一步的调查，特别是因为这些影响可能是物种特定的。

3.1.2. 提高微生物MEL生产的策略

(1).亲水性碳源

尽管使用疏水性碳源已导致极高的产品浓度，通常超过100 g/L，但它们的使用显著复杂化了生产纯化MEL产品所需的下游处理。这是由于MELs和残留油脂及脂肪酸之间的结构相似性，导致需要复杂的下游处理链来分离MELs和残留油脂。此外，亲水性碳源已被证明是相对昂贵的底物，阻碍了MEL生产的经济性能。

表2 在摇瓶中生产甘露糖赤藓糖脂。

某些属于Ustilago和Sporisorium属的黑粉菌具有从疏水性或亲水性碳源生产MELs的能力。Sporosorium scitamineum NBRC 32730显示出从蔗糖中高效生产MELs的能力，实现了12.8 g/L的产品浓度。尽管它比在油上培养的Pseudozyma属菌株实现的最佳浓度低一个数量级，但仍然是一个合理的产品滴度。尽管使用亲水性碳源生产MELs需要在产品浓度上做出重大牺牲，但它们的使用既改善了与底物相关的生产成本，也简化了生产纯化产品所需的下游过程。此外，成功应用亲水性碳源生产MELs为利用富含亲水性碳源的工业废物流生产MELs打开了大门。然而，应进行更多的研究，以实现从亲水性碳源获得竞争性的产品浓度。进一步的，需要进行经济建模，以评估最佳的培养途径。

(2).培养基成分变化

观察到通过向生产MEL的生物体提供构成MEL的水溶性前体分子，可以显著提高产品浓度。这包括向培养物中补充甘露糖和/或赤藓糖醇。Rau, Nguyen, Schulz等人观察到，在补充赤藓糖醇的情况下，P. aphidis DSM 70725在8%（体积/体积）大豆油上生长，MEL产量增加了10%-20%。通过在2天后向培养物中补充40 g/L赤藓糖醇，达到了75 g/L的最大MEL浓度。Morita等人观察到，通过补充葡萄糖和甘露糖，P. rugulosa NBRC 10877的MEL产量增加了50%，而补充赤藓糖醇则使MEL产量增加了70%-90%。最后，Kim等人展示了MELs可以从脂肪酸作为植物油的替代品中生产。这种生产途径受到一项专利的保护（Hee‐Sik, 2011年）。

(3).连续补料生产

其他研究调查了连续补料额外的亲水性碳源对MEL生产的影响。Morita等人观察到，通过每7天向P. rugulosa NBRC 10877培养物中补充80 g/L大豆油和20 g/L赤藓糖醇，连续28天，可以将MEL产量提高到142 g/L。这仍然是文献中报道的最高MEL产量。Konishi等人对P. hubeiensis KM 59获得了类似的结果。在批式发酵中，4天后达到了21.8 g/L的最大MEL浓度。但是，每4天补充40 g/L大豆油、20 g/L葡萄糖和2 g/L酵母提取物后，16天后可以将MEL浓度提高到最大74.3 g/L。在另一项研究中，研究表明P. parantarctica JCM 11752在孵化的第28天达到了最大MEL滴度，尽管从第7天开始就没有细胞生长。这种培养物不断地用大豆油喂养。这项研究的结果导致了一种专利的连续补料过程，用于通过属Pseudozyma的酵母从由油和脂肪组成的培养基中生产MELs。这些研究表明，通过实施连续补料系统，即使在细胞生长停止后，MEL生产菌株的生产能力也可能维持数周。

(4).两阶段生长系统

两阶段生长系统被确定为最大化植物油到产品的产量的潜在途径。这种生产策略如图4所示，包括一个初始生长阶段，在这个阶段，MEL生产微生物生物量在相对便宜的亲水性碳源上生长到高细胞浓度。在随后的生产阶段，生物量可以被喂养含有植物油的底物，这已被证明可以产生高浓度的MELs。这可能是通过实现植物油到MELs的改进转化，提高MEL生产过程的经济可行性的方法。

图4 展示了一个两阶段生长系统的潜在设置，该系统可以实现增强的甘露糖赤藓糖脂生产和最佳的底物利用。

这由Kitamoto等人展示，他们从P. antarctica T‐34的静止细胞中生产MELs。在生长阶段，生物量是通过利用葡萄糖作为唯一的碳源产生的。在生产阶段，生物量被转移到由8%（体积/体积）大豆油和蒸馏水组成的生长和氮限制培养基中。6天后报道了最终47 g/L的MEL浓度。重要的是，与标准单批生产相比，这代表了将大豆油转化为MELs的转化率提高了18%。生长阶段后收获和洗涤细胞所需的时间证明是与这个过程相关联的主要挑战。然而，这种洗涤过程并不一定必要。相反，植物油可以直接添加到耗尽的生长培养基上。两阶段生长系统的实施尚未被调查用于其他MEL生产微生物。

(5).基因工程用于提高和定向生产MELs

对MELs生物合成途径中涉及的基因的最新理解进展，为开发具有提高MELs生产能力的突变株打开了大门。Tran等人通过过度表达两种酰基转移酶（MAC1和MAC2）和乙酰转移酶（MAT1），成功将Candida sp. SY-16的MEL产量比野生株提高了31.6%。Saika等人通过将P. antarctica T-34中的两个脂肪酶基因（PaLIPA和PaLIPB）转移到改良株中，成功提高了Pseudozyma tsukubaensis的MELs产量。这些操作导致实现的底物产量显著增加。油转化为MELs的增加归因于脂肪酶活性的增加，表明某些微生物菌株的MEL生产可能受到其从植物油合成脂肪酸能力的限制。

这些分子生物学技术已被用于生产具有定向MEL生产能力的菌株。在P. tsukubaensis JCM 16987中阻断酰基转移酶基因MAC2，导致生产单酰化MEL变体，如Saika等人报道。此外，确定MELs在C2位置被酰化，表明MAC2负责C3位置的酰化。这是第一个支持酰基转移酶基因的区域选择性的证据。Konishi和Makino表明，在P. hubeiensis SY62中阻断乙酰转移酶（MAT1）只导致形成去乙酰化的MEL变体MEL-D。在这个领域的额外和正在进行的工作将继续改善菌株特性。

3.2.微生物MEL生产过程的可扩展性

在摇瓶中生产MELs已有广泛报道。这在理解影响微生物MELs生产的因子方面取得了显著进展，如前几节所讨论的。然而，很少有研究致力于在生物反应器中或更大体积生产MELs。可用的研究调查了MELs生产的可扩展性，总结在表3中。Rau等人报告了在搅拌生物反应器中生产MELs。该研究调查了两个P. aphidis株在72升罐发酵中的连续补料培养。这些菌株最初在67.8 g/L大豆油上生长，然后以0.3 g/L/h的速率补充37 g/L大豆油。这导致P. aphidis DSM 70725的最大MEL浓度为70 g/L，P. aphidis DSM 14930为90 g/L。未控制的泡沫在所有培养中被确定为挑战。为了最小化泡沫，搅拌器速度和通气速率不断调整。Rau等人然后旨在通过包括一个初始生长阶段23 g/L葡萄糖和17 g/L大豆油作为碳源，增加P. aphidis DSM 14930的最大细胞浓度。为了进一步促进细胞生长，培养在1.75至2.8天之间以125 mL/h的速率补充285 g/L葡萄糖、16 g/L硝酸盐和14 g/L酵母提取物的溶液。通过包括这个生长阶段，实现了最大细胞浓度的81%增加。在补充126 g/L大豆油后，实现了最大MEL浓度165 g/L。

Goossens等人调查了P. aphidis DSM 70725在22升搅拌生物反应器中连续补料生产MELs。最初提供74.3 g/L菜籽油作为唯一的碳源。通过在8.9天后向培养物补充55.4 g/L菜籽油，实现了69 g/L的最终MEL浓度。Yang等人然后通过优化培养基中的Fe2+和Fe3+水平，并利用大豆油的连续补料到1000升生物反应器，既作为额外的底物和消泡剂，成功提高了该菌株的MEL生产。最终，展示了最大MEL浓度76.6 g/L。Kim等人调查了Candida sp. SY 16在5升罐发酵中的批式和连续补料培养。最初，底物由15 g/L葡萄糖和15 g/L大豆油作为碳源组成。然后在1.8和4.3天后分别补充70和100 g/L大豆油。这导致最大MEL浓度达到95 g/L。

这些研究表明，各种MEL生产菌株能够在实验室规模培养到1000升规模的范围内实现产品产量。然而，为了保持生产力，必须向培养物中补充大量的植物油。这在这些规模的工艺经济性能上有显著的负面影响。因此，Mawani等人调查了P. antarctica MTCC 2706从5升罐发酵中的替代碳源生产MELs。优化的底物由22 g/L甜水（脂肪裂解工业的副产品）和7 g/L大豆油作为碳源组成。在7天后实现了最大MEL浓度21.5 g/L。与摇瓶中进行生产时相比，这代表了MEL浓度的185%增加，尽管仍然显著低于该生物使用其他底物的最佳性能。尽管如此，与其它工业规模培养相比，这种培养使用显著较少的大豆油。

表3 生物反应器中甘露糖赤藓糖脂的生产

这表明，使用亲水性和疏水性碳源混合物可以显著降低MELs生产中使用的底物的生产成本。然而，使用这些碳源可能需要在最终产品浓度上做出牺牲。

3.3.利用工业废物流生产MELs

已经研究了利用各种工业废物流作为微生物生产MELs的原料的潜力，旨在提高其可扩展性和经济性能。这包括使用高浓度脂质的废物流作为植物油的替代品，以及使用高浓度亲水性碳源，如糖的废物流，如表4所示。

Bednarski等人研究了利用炼油厂废物流作为植物油替代品生产MELs的潜力。这些废物在工业脂质精炼厂大量持续产生，因此被确定为可靠的底物，可能用于生产MELs。在研究中，P. antarctica ATCC 20509培养物被补充了50-120 g/L的皂脚或20-50 g/L的精炼后脂肪酸。观察到，分别添加100 g/L皂脚和40 g/L精炼后脂肪酸，最大MEL浓度分别达到13.4和10.4 g/L。这些滴度比纯碳源上的最佳滴度低一个数量级。在另一项研究中，Dzięgielewska和Adamczak研究了从不同的疏水废物流中生产MELs。这包括由生物柴油衍生的三种不同的甘油分数100 g/L，以及由P. antarctica ATCC 28323和P. aphidis DSM 70725产生的游离脂肪酸（FFA）、植物油的精炼后脂肪酸和皂脚200 g/L。P. antarctica ATCC 28323和P. aphidis DSM 70725培养物分别通过添加精炼后脂肪酸和皂脚，达到最大MEL浓度107.2和77.7 g/L。这些发现显示了用工业脂质废物替代植物油的潜力。

Niu等人随后研究了P. aphidis ZJUDM34从废食用油中生产MELs。据报道，实现了最大MEL浓度55 g/L，与在大豆油上培养该菌株实现的最大MEL浓度61 g/L相比表现良好。然而，废食用油并没有解决MELs下游处理的挑战，而是用需要纯化的额外化合物污染了产品。最后，与收集废食用油以确保该过程的稳定底物供应相关的挑战很大。

也研究了从仅含有亲水性碳源的工业废物流中微生物生产MELs，目的是简化生产纯化产品所需的下游过程。Faria, Santos, Fernandes, Fonseca等人研究了Pseudozyma sp.与五碳糖的增长和MEL生产。观察到P. antarctica PYCC 5048显示出从五碳糖中生产MELs的最高潜力，最大滴度达到5.8 g/L。在后续研究中，Faria, Santos, Fernandes, Fonseca等人研究了由商业纤维素酶分解成可消化糖的纤维素材料的MEL生产。通过P. antarctica PYCC 5048实施连续补料发酵和预水解步骤，获得了4.5和2.5 g/L的最大MEL浓度。这些研究的结果促使Faria等人调查P. antarctica PYCC 5048直接将纤维素和木聚糖转化为MELs，无需纤维素酶的存在。在40 g/L木聚糖上培养P. antarctica PYCC 5048，实现了最大MEL浓度1.3 g/L。通过在4天后向培养物补充40 g/L木聚糖，最大MEL浓度增加到2 g/L。这些研究表明了仅从纤维素材料生产MELs的潜力，尽管与基于油的发酵相比，最终产品滴度较低。这是MEL生产的替代途径，这样的原料很丰富。然而，需要用纤维素酶进行预处理以提高MEL生产，这是一个重大的开支。因此，随后的研究旨在从含有高浓度简单糖的废物流中生产MELs，而不是需要预处理的废物流。

表4 从工业废物流或替代底物生产甘露糖赤藓糖脂

Bhangale等人通过在14%（重量/体积）蜂蜜上培养P. antarctica ATCC 32657，以5.61 g/L的浓度生产MELs，而Madihalli等人通过在椰子水上培养P. antarctica JCM 10317，以3.85 g/L的浓度生产MELs。最后，Andrade等人通过在3升生物反应器中培养P. tsukubaensis，利用木薯废水生产MELs。最后，最近的研究旨在从结合疏水性和亲水性废物流中生产MEL。Nascimento等人通过在30%（体积/体积）乳清和20 g/L废食用油的组合上培养P. antarctica PYCC 5048和P. aphidis PYCC 5535，成功地以13.98和13.1 g/L的浓度生产MELs。类似地，Faria等人调查了P. antarctica PYCC 5048和P. aphidis PYCC 5535的生产，最初在40 g/L葡萄糖上培养，然后补充20 g/L废食用油。发现P. antarctica PYCC 5048和P. aphidis PYCC 5535分别实现了12.6和10 g/L的竞争性MEL滴度。这些研究表明了利用疏水性和亲水性废物流的组合实现增强的微生物MEL生产的潜力。尽管使用仅含有亲水性碳源的工业废物流解决了MELs下游处理的挑战，但这些底物与表4所示的底物产量和生产率的显著降低相关。因此，需要进一步的研究来确定这些牺牲是否从经济角度合理。

如预期，与纯碳源相比，从工业废物流生产MELs需要在产品产量和质量上做出重大牺牲。然而，利用这些废料作为底物显著降低了生产MELs所用底物的成本。如前所述，植物油的高成本限制了MEL生产的可扩展性。利用废物流作为底物可以使MELs的工业规模生产在经济上可行。然而，这些废物流组成的变异性，以及产品质量的下降，使得从这些废料生产的MELs因这些行业内的严格规定而不适合医疗或化妆品应用。这将限制从废物流中提取的MELs的适用性，最终降低它们的价值。

3.4.酶法后修饰生产特定结构变体的MELs

酶法后修饰已被确定为生产独特结构变体的MELs的有希望的方法。酶法后修饰侧重于通过用商业酶处理现有的同系物来生产新的MEL同系物。Fukuoka等人成功地通过用商业脂肪酶Novozyme 435处理由P. antarctica T-34生产的二酰化MEL-A，合成了三酰化MEL变体。类似地，Recke等人设法用来自其他糖脂的脂肪酸，包括鼠李糖脂和大豆磷脂，修饰二酰化MEL-A和单酰化MEL-B。这导致在C1位置形成具有不寻常脂肪酸链的三酰化MEL变体。这些结构变体表现出增强的表面活性和抗菌性质。

也有报道酶法脱酰化。在研究中，由P. tsukubaensis生产的单酰化MEL-B，在与固定化脂肪酶Novozyme 435反应后被脱酰化，产生脱酰化MEL-D。该实验重复进行二酰化MEL-A的实验，产生单酰化MEL-C。因此，得出结论，使用这种方法只能在这个位置上实现脱酰化。然而，在这两种情况下，脱酰化都导致形成了一种增加亲水性的MEL变体。当这些实验在由S. scitamineum生产的单酰化MEL-B上重复时，获得了类似的结果。这些发现表明，使用酶法后修饰改变现有MEL变体的酰化模式，以生产具有独特性质和应用的新结构变体的潜力。

此外，与通常导致独特结构变体混合物形成的微生物生产相比，酶法后修饰为生产的结构变体提供了更大的控制。

4.MELs的分离和纯化

4.1.MELs的下游处理

如第3节所述，已投入大量努力改进MELs的上游生产，导致超过100 g/L的卓越产品浓度。目前，总部位于日本的MEL生产公司TOYOBO（市场推广名为Ceramela™）已成功将MEL-B商业化，而另一家日本公司Nippon Fine Chemical Co. Ltd已将Phytopresome™ MEL商业化，这是一种MEL-B、氢化卵磷脂和多元醇的预混合物。然而，下游处理仍然是MELs工业规模生产的挑战，因为经济可行性与所需的下游纯化程度密切相关。鉴于与MELs生产相关的成本超过60%−80%归因于下游处理，因此，找出MELs纯化的高效且成本效益高的过程至关重要。已有几种下游处理技术被研究用于实验室规模的MELs纯化，包括溶剂萃取、吸附、膜过滤、柱色谱、泡沫分馏和倾析。以下各节将探讨这些下游处理技术，突出其在文献报告的MELs回收方面的优缺点。

4.1.1. 溶剂萃取

溶剂萃取是报道最广泛的MELs回收下游过程，其次是用于进一步纯化的柱色谱和HPLC。已经使用了多种溶剂，包括氯仿、乙酸乙酯、甲醇和丁醇等极性有机溶剂。额外的底物萃取使用非极性溶剂，如正己烷、戊烷和甲基叔丁基醚（MTBE），以去除残留油和游离脂肪酸（FFA），如果使用大豆油等疏水性底物进行MEL生产。表5列出了一些已报告的溶剂萃取系统，这些萃取技术如图5所示。

使用与培养基相同体积的乙酸乙酯进行溶剂萃取是实验室规模从培养悬浮液中提取MELs最广泛使用的下游过程。萃取后，分离有机层并蒸发，形成富含MELs的浓缩物。Rau等人开发了一种类似的萃取系统，使用MTBE，目的是分离由Pseudozyma antarctica DSM 14930生产的MELs，如图5c所示。

表5 文献中报告的使用不同溶剂萃取技术对甘露糖赤藓糖脂进行下游处理的研究（所有研究均使用大豆油作为碳源）。

图5 甘露糖赤藓糖脂分离和纯化工艺流程图概览：(a) 使用等体积乙酸乙酯进行分离。(b) 使用乙酸乙酯、甲醇和色谱进行分离和纯化。(c) 通过一系列提取进行分离和纯化。(d) 通过一系列使用甲醇/水/正己烷提取系统的提取进行分离和纯化。

然而，这个过程导致产品损失超过90%，并且形成大量有毒废溶剂。Shen等人开发了一种使用甲醇、水（pH 2）和正己烷溶剂混合物的萃取系统，如图5d所示。在这项研究中，从培养悬浮液中回收了90%的MELs。

尽管有机溶剂萃取是一种有效的技术，并且通常用于回收MELs，但这个过程有一些缺点。例如，这种技术通常涉及使用有机溶剂混合物，这需要复杂的循环利用过程，因为会形成稳定的共沸物。此外，这些过程与高溶剂消耗率有关，这可能成本高昂，并对环境有潜在危害。基于这些原因，研究的重点已转向将溶剂萃取技术与补充分离方法（如膜过滤或酸沉淀）整合。这避免了MELs下游处理过程中所需的大量有毒溶剂混合物，并减轻了相关的回收和处置挑战。第4.1.2节将进一步探讨这种集成方法。

表6 文献中报告的甘露糖赤藓糖脂不同膜过滤技术的下游处理。

MELs下游处理的一个重大进展是通过酸水解和随后的正己烷萃取来纯化亲水性MELs的方法。然而，酸水解引入了与酸试剂的处理和处置有关的挑战，以及需要仔细控制酸水解反应，以防止不希望的副反应或所需MELs的降解。因此，酸水解步骤的可扩展性、成本效益和环境影响应在大规模工业生产的背景下进行彻底评估。

另一项专利提出了一种从假单胞菌微生物培养中回收和纯化MELs的替代方法。这种方法采用特殊设备，如大型连续离心分离器，从而免除了有机溶剂萃取的要求。该技术涉及在水介质中通过MELs和脂肪酸的共存创建水不溶性聚集体。随后的MELs和脂肪酸的分离发生在这种聚集体中。

与当前方法不同，集成发酵方法对于MELs的分离和纯化可能至关重要，特别是在预处理木质纤维素生物质时释放的副产品抑制微生物生长并限制生产力的情况下。Teke等人强调了溶剂萃取（使用实验和计算建模）与半隔板生物反应器（SPB）配置的有效性，该配置将发酵和分离结合在一个单元内。这种与传统设置的背离在SPB内结合了溶剂萃取，提供了一种新方法，有潜力应用于MELs的生产，简化了回收过程，同时提高了产量和回收率。

4.1.2. 膜过滤

膜过滤是另一种已被探索用于从培养悬浮液中提取MELs的方法。已经研究了不同类型的膜，如聚矾（PS）和聚醚矾（PES）膜以及再生纤维素膜。然而，de Andrade等人报告称，陶瓷膜作为替代现有的聚合物膜的膜材料具有更大的潜力，因为陶瓷膜对有机溶剂的抵抗力增强，且操作寿命延长。

在超滤单元的使用中，Andrade等人报告称，100 KDa MWCO超滤膜在20 mL离心装置中使用，可以从在木薯废水上培养的P. tsukubaensis生产的MELs中回收约80%。当超滤程序扩大规模（高达500 mL）使用交叉流过滤单元时，结果保持不变。扩大这种分离的复杂性尚未被完全调查（表6）。

膜过滤特别有吸引力，因为不会产生有害残留物，并且由于其简单的操作和低能耗，可能相对容易扩大规模。然而，膜过程受到膜污染的限制，这会导致由于设备效率降低而失去生产力，增加清洁成本，以及微生物污染问题。此外，该过程选择性不高，因为分离仅基于化合物大小，即所有小分子将与MELs一起被收集。

Nascimento等人的一项研究通过开发一种集成溶剂选择性溶解的回收和纯化过程来解决分离具有可比摩尔质量的分子的挑战，该过程将三酰甘油（TAGs）与MEL分离，然后通过有机溶剂纳米过滤去除较小摩尔质量的脂质衍生物，如游离脂肪酸和单或二酰甘油。如图6所示的提议过程，为从基于脂质的底物生产的MELs的纯化提供了双重好处，有效地解决了将与MELs具有相似摩尔质量的分子分离的挑战，并消除了溶剂混合物，实现了溶剂回收和再利用。

图6 展示了一个提议的下游处理过程的示意图，该过程整合了溶剂选择性溶解和有机溶剂纳米过滤（OSN）技术，用于纯化甘露糖赤藓糖脂。

4.1.3. 酸沉淀

酸沉淀也被提出，以通过减少提取MELs时所需的溶剂体积来提高溶剂萃取技术的性能。Kitamoto, Akiba等人观察到，当Pseudozyma antarctica T‐34的发酵液的pH值降至3时，MELs会与蛋白质、残留脂肪酸和残油一起沉淀。这种沉淀物可以通过固液分离方法（如离心）轻松回收。需要注意的是，由于微生物对下游分离过程的干扰，沉淀方法可能具有挑战性——微生物也会与沉淀的MELs一起被收集。因此，在实施原位沉淀过程之前，可能需要额外的细胞分离技术。在Kitamoto, Akiba等人的研究中，观察到在降低pH值时MELs与酵母细胞和油一起沉淀，可能与它们在发酵液中与其他组分（如蛋白质、油和游离脂肪酸）的关联有关，而不是对pH变化的直接反应。虽然酸沉淀有助于MELs与这些成分一起共沉淀和随后分离，但由于它们的非离子性质，酸沉淀对直接沉淀MELs的直接影响可能有限。

4.1.4. 泡沫分馏

泡沫分馏也作为一种有前途的方法出现，用于生物表面活性剂的纯化，因为它具有成本效益和连续产品去除的可能性。泡沫分馏是通过利用生物表面活性剂倾向于吸附在穿过发酵罐上升的空气泡上来进行的。然后可以从罐顶收集富含生物表面活性剂的泡沫，并将其引导至泡沫收集罐。此外，这些收集罐可以配备不同类型的插入物，生物表面活性剂可以吸附并被收集。图7展示了一个用于连续纯化的泡沫分馏柱的设置，用于纯化纤维素二糖脂，这是一种由S. scitamineum从亲水性碳源生产的糖脂生物表面活性剂。

采用泡沫分馏的可行性取决于几个关键因素。首先，MELs的表面活性起着关键作用，因为它们吸附在气液界面的能力决定了分离的有效性。因此，只有在亲水性碳源上生长的培养物中才可行，因为植物油等疏水性碳源具有消泡性质。因此，要实施连续泡沫分馏用于MELs的纯化，需要开发仅使用亲水性碳源的过程。此外，泡沫分馏期间也可能排出生物量，降低有效的生物量负荷，因此随着时间的推移降低反应器的体积生产力。

唯一研究通过泡沫分馏纯化MELs的研究是由Andrade等人进行的，尽管许多研究已经检查了该技术用于其他生物表面活性剂，如脂肽。在Andrade研究中，确定在甜水上培养的P. tsukubaensis培养物的反应器顶部的泡沫含有MELs，浓度相对较低，为1.3 g/L。

5.未来展望

MEL相关研究的第一阶段集中在识别能够有效生产MELs的微生物菌株，以及了解影响其生产的因素。这些研究导致了对实验室规模摇瓶中MEL生产的最佳条件有了很好的了解。观察到植物油，尤其是大豆油，是Pseudozyma属微生物菌株生产MELs的最佳碳源。然而，使用植物油作为MELs生产的底物会出现几个问题。这包括与底物相关的高生产成本，以及由于MELs和残油之间的结构相似性，需要生产纯化产品的下游过程的复杂性增加。因此，为了开发一种成本效益高的生物过程，用于工业规模生产MELs，未来研究的重点应该旨在找到解决这些挑战的解决方案。

图7 用于连续分离纤维二糖脂的泡沫分馏柱的设置。在发酵过程中形成的泡沫通过泡沫柱流动到带有插入物的泡沫收集罐中，在这些插入物上生物表面活性剂可以累积。然后可以将泡沫渣重新循环回到发酵罐中，并添加新鲜的生长培养基。

作为解决这些问题的初步方法，研究可以旨在确定用于生产MELs的替代碳源。已经观察到某些黑粉菌，包括U. maydis和S. scitamineum，具有在没有植物油的情况下生产MELs的能力。这可能导致识别丰富且成本效益高的底物，这些底物不会像植物油那样抑制MELs的下游处理。

或者，为了降低从植物油生产MELs的高运营成本，研究可以旨在最大化植物油转化为MELs的微生物转化率。这可以通过优化微生物MEL生产过程的操作条件来实现，或者通过实施更先进的发酵协议或微生物技术，如连续补料发酵系统或基因工程。

据估计，与生产MELs相关的总体处理成本的60%-80%可以归因于下游处理。因此，为了在工业规模上有效生产MELs，应该努力通过开发更有效的分离技术来改善MELs的下游处理。此外，工业规模上有效生产MELs不仅需要从发酵液中有效回收MELs，还需要坚定地关注先进的纯化技术，以满足MELs各种工业应用的严格质量要求。因此，除了整合有效的分离技术如原位产品回收外，优先考虑和完善纯化策略在确保大规模生产中MELs的质量和纯度方面仍然至关重要。

6.结论

本综述总结了MEL生产方面的研究。从这项研究中，很明显在上游生产方面已经展示了大量的工作，使用了Pseudozyma、Ustilago、Candida和Sporisorium等属的菌株。已经研究了影响MEL生产力的不同因素，与上游生产一致，包括培养基优化、碳源选择和氮源选择。尽管已经展示了改善的产量和产品浓度，但需要更多的研究来开发可扩展的上游生产策略。在下游分离和纯化方面，进一步的研究将是有益的；尽管目前，使用当前方法已经成功商业化生产MELs。溶剂萃取被广泛使用，通常使用两种溶剂 - 初步将MELs与培养基分离，然后清除粗MEL提取物中的残留油和脂肪酸。已经有研究检查了替代下游工艺选项，如膜分离或泡沫分馏。无论如何，MEL开发领域是一个不断发展的领域，需要进一步的工作来促进工业应用的发展。

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