间充质干细胞衍生的细胞外囊泡摄取和体内分布依赖于蛋白冠层

学术 2024-12-17 16:42 上海

撰文│徐海斌

编辑│毕紫娟

审校│汤红明

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【据《Nature Nanotechnology》2024年2月报道】题：间充质干细胞衍生的细胞外囊泡摄取和体内分布依赖于蛋白冠层（英国伦敦国王学院生命科学与医学学院制药科学研究所作者Khuloud T Al-Jamal 等）（原文链接.pdf）

慢性肝病普遍具有持续的炎症、氧化应激及瘢痕形成等显著特征。这些因素相互作用，导致肝脏状况持续恶化，致使肝硬化出现，最终引发肝功能衰竭，甚至造成患者死亡。这一病理过程涵盖了多个肝细胞亚群，如肝细胞、肝星状细胞、巨噬细胞及淋巴细胞等。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）衍生的细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）因其再生和免疫调节特性，在肝病治疗中展现了广阔前景，但外源性EVs又极易被吞噬细胞快速清除。因此，英国伦敦国王学院生命科学与医学学院药物科学研究所的研究人员探讨了EVs表面吸附来自培养基的特定蛋白形成的蛋白冠层对其性质的影响，并通过将EVs与血清孵育，模拟系统给药后的蛋白冠层形成。研究发现，体外冠层组成可能会影响EVs性质及其体内行为，特别是结合的白蛋白为EVs创造了一种特征，能够将EVs重新靶向至肝巨噬细胞，显著提高肝细胞、肝窦内皮细胞和肝星状细胞摄取。通过在EVs表面预先修饰白蛋白，可制备富含白蛋白的蛋白冠层-EVs复合物，作为伪装策略，增强肝脏中非吞噬性细胞的摄取。这项研究通过优化蛋白冠层-EVs复合物，实现了靶向肝细胞并逃避免疫系统的目标，为EVs在肝脏疾病中的应用提供了新方案。

研究团队分别从2D和3DMSC培养中提取无血清条件培养基（CCM）和含KnockOut（KO）血清替代品的CCM，进行EVs分离。分析结果显示，测量的EVs 的蛋白含量及颗粒与蛋白比率（P:P）均在可接受纯度范围内。且EV_2D和EV_3D在表面电荷和大小方面相同。

为了模拟EVs与血清蛋白在体内的相互作用，研究人员将EV_2D和EV_3D暴露于去除50%（v/v）EVs的胎牛血清（FBS）中，通过超速离心和蛋白冠层脱附，获得了结合硬冠（HC）的EVs（HC-EV_2D和HC-EV_3D）、HC层（HC_2D和HC_3D）及剥离HC后的EVs（strip-EV_2D和strip-EV_3D）。结果表明，暴露于FBS后，EVs表面形成了HC，使得HC-EV_2D和HC-EV_3D吸附了不同蛋白组合，且HC_2D和HC_3D蛋白条带表现出相似差异模式。在剥离HC后的样本中，蛋白条带差异消失。总的来说，培养补充剂会影响EVs上蛋白冠层成分。研究人员进一步将来自CCM和FBS的蛋白冠层定义为初级冠层和次级冠层。

通过液相色谱-质谱法（LC-MS）分析，研究人员揭示了EV_2D和EV_3D在蛋白质富集模式上的显著差异。EV_2D中的主要蛋白包括胞质1型肌动蛋白和免疫球蛋白重链恒定区μ；而EV_3D中富集了血清白蛋白、m7GpppN-mRNA水解酶等蛋白。尤其是牛源白蛋白，总的来说，LC-MS数据支持之前银染十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果，表明EV_3D培养条件促使EVs上富集白蛋白的冠层形成，验证了培养条件对EVs蛋白特性的影响。

随后，研究人员探讨了EVs在肝细胞与吞噬细胞中的摄取情况。结果显示，带有HC层的HC-EV_2D显著增加了吞噬细胞摄取，HC-EV_3D则显著增加了肝细胞摄取，显示出在肝脏微环境中更有利的摄取特性。

研究人员还在小鼠中进行了生物分布研究，以确定在体外发现的差异是否在体内普遍存在。将DiR标记的EV_2D和EV_3D静脉注射小鼠体内，并在24小时后进行光学成像。结果显示，EV_3D在肝脏和脾脏积累最高，对应区域信号最亮。主要器官的体外成像进一步支持了这一结果，并通过半定量分析确认了EV_3D在肝脏中的积累显著高于EV_2D。研究还检测了尿液中的DiR信号，以评估肾脏清除率，发现EV_3D的清除率较低。

最后，为了解EVs的体外和体内行为、生物过程和蛋白冠层组成是否存在相关性。研究团队通过LC-MS鉴定了EVs及其HC层的蛋白，并使用基因本体论对这些蛋白进行功能分类。结果显示，EV_3D和HC_2D中的蛋白涉及EVs清除的生物过程，且孵育后HC中的蛋白在非人类哺乳动物（牛）数据库中表现出显著富集。使用FunRich软件进行主成分分析，揭示EV_2D与EV_3D及HC_2D与HC_3D的显著蛋白成分差异，其中HC_2D的蛋白与较高补体激活相关联。为了验证白蛋白对EVs摄取的作用，研究人员发现，阻断白蛋白受体可减少EV_3D体外摄取。体内实验中，与牛血清白蛋白共同使用时，EV_3D在肝脏中积累和摄取显著减少。此外，白蛋白涂层的EV_2D在所有细胞类型中摄取量较高，但预孵育未增强细胞摄取。这些结果表明，不同EVs类型的蛋白冠层成分显著影响其功能特性，尤其是肝脏和肾脏的清除机制。

综上，研究创造性地提出了一种独特的外泌体复合物。这种复合物通过白蛋白预加载的方式，能够实现针对肝细胞的靶向递送。在未来探索中，对于单个蛋白具体功能，还有更广阔的研究空间。值得一提的是，研究团队构建的原始模型，展现出极大潜力，它有可能被应用于开发源自其他细胞来源的高效载体，为相关领域发展带来新契机。

（ID:yxckbsc2024050802）

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