Bioactive Materials｜同济大学附属东方医院何志颖教授团队建立胆管树干细胞类器官激素与化学成分确定的扩增条件

学术科学 2024-10-31 16:44 上海

撰文│何志颖

编辑│毕紫娟

审校│汤红明

全文1800余字，预计阅读8分钟

人胆管树干细胞（biliary tree stem cells, BTSC）是位于肝内、外和胰外胆管树壁内胆管周腺（peribiliary tree glands, PBG）内干细胞龛中的肝/胰腺共祖干细胞。在器官发育和再生过程中，BTSC可产生多种干细胞亚群，一方面向位于赫林管内或附近肝干细胞（hepatic stem cells, HpSC）及其后代肝母细胞（hepatoblast, HBs）分化介导肝再生。另一方面，通过分化为位于肝/胰腺总导管的PBG的胰腺干细胞介导胰腺再生。

2024年9月11日，上海市东方医院（同济大学附属东方医院）干细胞基地再生医学研究所、同济大学生命科学与技术学院何志颖教授、张文成副研究员团队与美国北卡罗来纳大学教堂山分校（UNC-CH）Lola Reid教授团队在Bioactive Materials上发表题为“Hormonally and Chemically Defined Expansion Conditions for Organoids of Biliary Tree Stem Cells”的研究论文（原文链接.pdf）。研究建立了一个完整定义的BTSC类器官扩增体系，该体系通过分析确定BTSC类器官体外扩增微环境的必须组分，建立了名为BTSC水凝胶扩增体系（Biliary tree stem cell expansion hydrogel system, BEX），成功实现了对BTSC及其类器官成千倍的扩增。扩增后的BTSC及其类器官不但在体外可分化为功能性肝细胞。在体内，通过项目组前期建立的干细胞补片移植，可有效救治肝衰竭小鼠。该体系的建立，为BTSC在临床应用中提供了充足数量且具完整功能的种子细胞。

为了明确BTSC的候选有丝分裂原，研究通过比较BTSC与成熟肝实质细胞的转录组图谱，确定BTSC干性维持的关键信号通路（如Hippo、PI3K/AKT、MAPK和Ras信号通路）。通过结合研究团队前期对胚胎干细胞（embrynic stem cells, ESC）和胃上皮细胞来源的内胚层干细胞的研究，确定了包括0.5μM Bix01294、2μM Bay K8644、0.04μM RG108、2μM SB431542、10μM毛喉素和1μM A83-01等小分子化合物，与50 ng/mL EGF、100 ng/mL R-Spondin1（RSPO1）、100 ng/mL Noggin和50 ng/mL Wnt3a等生长因子或旁分泌信号组合构成10因子-确定增殖培养基（10-Defined-Proliferative-Medium, 10-DPM），成功实现了原代BTSC的扩增（7天实现20倍扩增）。后续研究发现，10-DPM不但可以有效维持BTSC的传代扩增，而且在结合水凝胶（Matrigel或者透明质酸-肝素水凝胶）的三维扩增体系下，可以获得BTSC类器官，并实现BTSC类器官的长期扩增传代。

对于10-DPM展开组合优化筛选结果证实，在所有的小分子化合物中，DNA甲基化酶抑制剂RG108、TGFβ信号通路抑制剂A83-01、cAMP激动剂毛喉素、钙离子通道激动剂Bay K8644组成的4-DPM是原代BTSC扩增的必须组分。然而，在缺乏Wnt信号通路的激活配体RSPO1的情况下，BTSC的传代和类器官的形成和持续传代能力受到了明显影响。而添加RSPO1组成的5-DPM可以发挥与10-DPM相当的促进原代BTSC增殖、BTSC二维扩增和BTSC类器官形成和长期扩增维持的能力，因此证实了Wnt信号通路在BTSC扩增和BTSC类器官形成中扮演的关键角色。

比较二维条件，基于水凝胶的三维扩增体系展现出明显的优势。在5-DPM作为扩增培养基的情况下，水凝胶预处理的二维体系仅能在有限代次内维持BTSC属性。相比之下，BTSC类器官可在5-DPM条件下，稳定传代20代以上，实现60天内完成3000倍以上的细胞扩增。通过对二维和三维条件下扩增的BTSC的转录组图谱进行比较分析，结果发现，三维扩增体系可以最大限度地减少细胞增殖过程中产生的DNA损伤，从而为细胞提供二维单层培养中所缺乏的损伤保护。

在确认了培养基后，研究进一步对水凝胶的成分进行了优化。与其他三维培养扩增研究相似，研究中首先借鉴了Hans Clevers等团队基于Matrigel的类器官形成和维持体系。Matrigel（康宁）主要由四种主要的基底膜成分组成，包括层粘连蛋白（约60%）、IV型胶原（约30%）、巢蛋白（约8%）和硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPGs），尤其是串珠蛋白（约2~3%）。其他组分的生物学活性已经有大量研究，但其独立于蛋白多糖的糖胺聚糖尚未确定。通过结合BTSC体内微环境中的糖胺聚糖组分，并在透明质酸水凝胶中添加硫酸乙酰肝素及其蛋白多糖组分（HAHS），成功地实现对Matrigel的替代。并最终与5-DPM结合，形成成分确定的BTSC类器官体外扩增的BEX体系。

研究建立了BEX体系，实现了BTSC及其类器官的体外大量扩增，扩增后的BTSC具有肝向分化和救治肝衰竭模型的能力，为推动基于BTSC移植救治肝衰竭的临床转化应用提供稳定的种子细胞制备体系。

同济大学附属东方医院干细胞基地再生医学研究所何志颖教授、张文成副研究员和美国北卡罗来纳大学教堂山分校Lola Reid教授为本文通信作者，锦州医科大学硕士研究生崔洋洋、路梦琦及同济大学生科院博士研究生徐茗扬、李玉婷为共同第一作者。研究获得国家科技部重点专项、国家自然基金委、上海市科委及上海市高峰学科等项目的资助。

扫码关注

干细胞基地管理文章合集

【01】加强干细胞临床研究质量控制的策略探讨

【02】关于推进干细胞临床研究的若干思考

【03】医疗机构干细胞临床研究学术委员会建设现状与对策思考

【04】我国干细胞研究的伦理学问题及对策探讨

【05】双备案制度下干细胞临床研究角色职责的转变及应对策略

【06】关于推进干细胞产业化的思考——以医疗机构和企业为视角

【07】加强干细胞科技成果转化的策略探讨

【08】干细胞产业发展探索—浅谈上海市东方医院在干细胞转化领域的实践

【09】临床生物样本库建设的思考

【10】干细胞资源库安全管理体系建设的思考