干细胞检测（三）｜干细胞微生物学安全性检测

学术 2024-12-06 15:30 上海

撰文│张萌

编辑│毕紫娟

审校│汤红明

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组稿策划人

白志慧

上海市东方医院（同济大学附属东方医院）干细胞基地GMP实验室副主任兼质检部主任

担任上海市东方医院人体细胞临床研究伦理委员会委员、中国整形美容协会干细胞研究与应用分会第二届理事会理事，以及全国生化检测标准化技术委员会细胞检测工作组的成员，长期从事干细胞质量检测与管理工作，组织通过CNAS ISO/IEC 17025认可，为8项国家备案的干细胞临床研究项目提供质检和放行检验服务，推进3项干细胞药品申报，获2项IND批件。申请3项发明专利，授权1项，发表7篇论文（含2篇SCI），参与制定1项行业标准和4项国家标准。

干细胞技术在再生医学和细胞治疗领域展现了巨大的应用潜力。为了确保干细胞产品的安全性、有效性和质量稳定，必须经过一系列严谨的检测和控制。干细胞关键检测内容包括基本生物学属性、生物学安全性、微生物学安全性、生物学有效性、理化检测和残留检测。

基本生物学属性检测：基本生物学属性检测是干细胞产品质量评估的基础，涵盖细胞活率、群体倍增时间、细胞周期等。通过这些检测，研究人员可以确保干细胞在治疗应用中的活性和功能不受影响，保证其在临床治疗中的有效性。

生物学安全性检测：干细胞产品在临床应用中的生物安全性至关重要。生物学安全性检测包括基因突变、肿瘤形成风险和免疫反应评估。通过成瘤性和遗传稳定性检测，可以确保干细胞在体内不会引发恶性变化或其他安全隐患。

微生物学安全性检测：为了防止干细胞产品在生产和储存过程中受到微生物的污染，必须进行严格的微生物学安全性检测。无菌检测、支原体检测、病毒检测有助于确保干细胞制剂不含病原微生物，确保其在临床应用中的安全性。

生物学有效性检测：干细胞产品的生物学效力试验是确保其在临床应用中发挥预期疗效的重要检测手段。通过分化能力、免疫调节功能等的评估，研究人员能够验证干细胞的治疗潜力，并为其在疾病治疗中的应用提供科学支持。

理化检测：理化检测主要针对干细胞产品的外观、pH值、渗透压等物理化学特性进行评估。这些指标对于产品的质量一致性和安全性至关重要。例如，干细胞制剂的渗透压必须符合人体的生理条件，以避免临床使用过程中引发不良反应。此外，可见异物的检测有助于排除产品中潜在的物理污染物，确保产品在使用过程中的安全性。

残留检测：干细胞产品的残留检测旨在确保制剂中的外来物质，如培养过程中使用的消化酶、冻存液等，未对产品的质量和安全性造成影响。常见检测项目包括DMSO（冷冻保护剂）残留检测、病毒残留检测等。这类检测能够避免潜在的毒性反应或免疫反应，确保制剂的纯度和安全。

【编者按】本公众号邀请了GMP实验室东方医院干细胞基地的白志慧副主任组稿了干细胞检测的系列文章，将分6期推出并详细为大家介绍。第一期推出了《干细胞检测（一）｜了解干细胞产品质量的秘密：基本生物学属性检测》，第二期推出了《干细胞检测（二）｜干细胞应用的生物学安全性》，本期推送干细胞检测系列文章的第三篇：干细胞检测（三）｜干细胞微生物学安全性检测。干细胞技术是现代医学的前沿技术，因其强大的分化能力和自我更新能力，为再生医学、疾病治疗和组织工程带来了无限可能。由于干细胞的特殊生物学特性及临床应用的高敏感性，微生物安全成为其研发、生产和应用过程中不可忽视的关键环节。任何微生物污染（如细菌、真菌、病毒、支原体等）都可能导致细胞疗法的失败，甚至对患者健康构成威胁。

一、为什么微生物学安全性检测对干细胞很重要

保证细胞质量和功能

安全性保障：干细胞用于医疗目的时，必须确保其不携带有害微生物。如果干细胞被细菌、真菌、病毒等微生物污染，植入患者体内后可能引发严重感染，危及患者生命。通过严格的微生物检测，可以最大程度地降低这种风险，保证干细胞治疗的安全性。

有效性维持：微生物污染可能影响干细胞的活性和功能。例如，某些细菌产生的毒素可能对干细胞造成损害，导致其无法正常发挥治疗作用。检测微生物可以及时发现潜在的污染问题，确保干细胞的质量和有效性。

符合法规和行业要求

监管合规：在干细胞生产、储存和临床应用过程中，各国监管机构（如美国FDA和中国NMPA）都制定了严格的质量标准和规范，其中包括对微生物检测的要求。进行微生物检测是满足监管要求的必要步骤，有助于确保干细胞产品的合法性和合规性。

行业规范：干细胞行业也有自身的质量控制标准和规范，如《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》《中华人民共和国药典》《人源干细胞产品药学研究与评价技术指导原则(试行)》等均明确了对微生物安全的要求。遵守行业规范可以提高干细胞企业的信誉度和竞争力，促进整个行业的健康发展。

保障患者权益

降低风险：患者在接受干细胞治疗时，承担着一定的风险。严格的微生物检测可以减少因微生物污染导致的治疗失败和并发症的发生，降低患者使用的风险。

增强信心：在质量控制体系中，微生物检测环节的透明和高标准执行能够增强患者对干细胞治疗的信任，从而促进干细胞疗法的普及和应用。

二、如何实现干细胞微生物学安全性控制

对干细胞进行微生物学安全性控制是确保其安全性和临床应用的关键步骤，贯穿于干细胞生产、存储和使用的全过程。

源头控制

环境管理：保持环境中的正常温湿度，维持生产环境的洁净度，定期监测空气中悬浮粒子和微生物浓度，确保达到无菌生产标准。

供者筛查：采集干细胞前，应对供者进行全面健康评估，筛查传染性疾病（如乙肝、艾滋病等）及活动性感染。

采集过程控制：供者细胞采集需对环境进行控制，尽量减少污染。

采集后样本检测：采集完成后，对样本进行微生物检测，包括细菌、真菌、支原体、病毒和内毒素的检测，以确保干细胞样本质量的源头。

物料控制

所有培养基和添加物等必须选择高质量且无污染的产品。对所有进入生产环节的原辅料进行微生物安全性检测，包括无菌检测、支原体、病毒和内毒素检测，以确保原料安全性和无污染。

建立物料追踪系统，记录每批次物料的来源、检测结果和使用情况，以便进行追溯。

干细胞中间控制

在干细胞制备和生产过程中，中间控制是保障产品质量和安全性的重要环节。这些控制措施贯穿干细胞的分离、扩增、培养、分装等各个步骤，要求是每次进行细胞操作后取样进行细菌、真菌和支原体和内毒素的检测，发现污染即刻处理，避免污染扩散。

生产区域定期进行空气、台面和设备的微生物检测，确保生产环境始终符合洁净标准，保证最终产品符合临床或研究的质量要求。

干细胞的质量研究

干细胞的质量研究是确保其在临床和研究中安全、有效使用的核心内容。质量研究涵盖干细胞来源、扩增、分化、表型、遗传稳定性等多个方面，其中在微生物安全上会对干细胞样本中的细菌、真菌、支原体、病毒和细菌内毒素进行全面检测，保障干细胞的安全有效。

放行检测

在干细胞制品投入使用前，需进行严格的放行检测。由于干细胞制品的特殊性，放行检测要求对细胞制剂进行快速放行检测，主要是无菌、支原体和细菌内毒素检测，检测完成并结果合格后才会予以放行使用，确保产品符合临床安全标准。

三、干细胞微生物学安全性检测技术有哪些

干细胞微生物学安全性检测主要有支原体检测、无菌检测、细菌内毒素检测和病毒检测。

支原体检测方法

药典支原体检查法：包含培养法和指示细胞培养法（DNA染色法）。

培养法是将供试品分别接种于含有精氨酸和不含精氨酸的支原体培养基中，若有支原体污染会改变培养基pH，使培养基变色；

指示细胞培养法是将供试品接种于指示细胞中培养后，用特异荧光染料染色，如支原体污染供试品，在荧光显微镜下可见附在细胞表面的支原体DNA着色。

培养法的灵敏度可达1-10CFU/ml，指示细胞培养法灵敏度相对较低，且容易出现假阴性的情况。

qPCR法检测支原体：药典支原体检查法作为检测支原体的标准方法，由于检测周期长，不适用于干细胞类产品放行。qPCR方法对细胞类产品快速放行且灵敏度要求不低于药典法，可作为培养法的替代方法，但需要对qPCR法进行全面的方法学验证，与药典法同步进行积累数据。

ELISA检测法：是通过检测支原体相关抗原或抗体来判断是否有支原体污染，适用于高通量筛查，但是需要优化试剂条件，且灵敏度低于qPCR法。

无菌检测方法

药典无菌检查法：包含直接接种法和薄膜过滤法。
直接接种法是将供试品直接接种于适宜的培养基中，培养一段时间后观察是否有微生物生长；

薄膜过滤法是将供试品通过薄膜过滤，然后用冲洗液冲洗滤膜，将滤膜转移至适宜的培养基中培养。

呼吸信号法：基于检测微生物生长信号的仪器方法，采用商品化全自动微生物培养系统，通过仪器实时监测微生物生长代谢产生的二氧化碳引起的培养瓶内反应底物的显色或荧光变化信号，或培养瓶顶空压力变化信号，结合目视观察，判定供试品中有无微生物生长。该方法已纳入《中华人民共和国药典(2020年版)第一增补本》中。

qPCR法检测细菌：药典无菌检查法作为检测细菌的标准方法，检测周期长，不适用于干细胞类产品放行。通过qPCR法检测细菌，不仅可以快速确认污染与否，还能进行定量分析，为细胞制品的安全性提供有力保障。但需要对qPCR法进行全面的方法学验证，确定其灵敏度。

革兰氏涂片法：是一种经典的细菌分类染色方法，通过对细菌细胞壁结构的差异进行染色分类，将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，该方法因其快速、简便，被广泛应用于临床诊断、微生物学研究及细胞培养中的污染检测，但因人工观察误差比较大，且对于微量的细菌污染不容易鉴别。

细胞内毒素检测方法

凝胶法：通过是否形成凝胶来判断内毒素的存在与否，仅做定性检测。

浊度法：通过测量反应液的浊度变化来确定内毒素含量，灵敏度高，适合定量检测，但需要特定仪器。

显色法：利用内毒素与特定显色底物反应产生颜色变化，通过测定吸光度来定量内毒素，灵敏度高，适合定量检测，但检测系统复杂。

重组C因子法：C因子是鲎试剂中对细菌内毒素敏感的蛋白，能够选择性识别内毒素。重组C因子是一种人工合成的C因子，被细菌内毒素活化后，可与荧光底物作用产生与内毒素浓度成比例的荧光信号。特异性强，但成本较高。

病毒检测方法

qPCR和RT-qPCR法：检测病毒DNA或RNA，尤其适用于常见的人类病毒（如HIV、CMV等），灵敏度高，特异性强，但需要针对目标病毒设计引物，不能全面筛查未知病毒。

病毒培养法（指示细胞接种法和动物体内接种法）：将样品接种到特定宿主中，包括体外指示细胞、体内鸡胚、乳鼠、小鼠等，观察病毒引起的细胞病变效应（CPE）、动物致死及病理变化等，结合血凝、血吸附试验检测病毒污染。此方法可以检测到活病毒，但是检测耗时较长，检测技术复杂。

NGS（高通量测序）：用于检测样品中的病毒核酸序列，能够发现已知和未知病毒，其覆盖面广，灵敏度高，但是检测成本高，数据分析复杂。

四、总结

干细胞微生物学安全性检测是干细胞研究与应用中不可或缺的一环。从源头控制到生产过程监测，再到最终产品放行检测，微生物安全贯穿于干细胞研发和应用的全生命周期，它为干细胞的质量和安全提供了有力保障。微生物学安全性检测技术不断发展，亟需快速、高效、灵敏度高的检测技术，例如数字PCR法、等温扩增技术等也在被探索应用于微生物安全检测。

撰稿作者简介

张萌

现任国家干细胞转化资源库、上海市东方医院（同济大学附属东方医院）干细胞基地GMP实验室质检员，主要负责间充质类干细胞和诱导多能干细胞的细胞学属性检测、微生物检测和理化特性检测等质量研究，现正在主持开发支原体、细菌和病毒检测试剂盒。

现任

审稿人 徐国东

现任武汉珈创生物技术股份有限公司研发总监，微生物学博士，高级工程师。多年来专注于生物制品质量研究，在细胞质量控制领域积累了丰富的经验。发表SCI论文5篇，授权发明专利17项。主持多项省市科研项目，先后获得湖北省科技进步二等奖、湖北省科技成果推广三等奖、光谷3551创新人才。

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