肝前体细胞与肝脏再生修复

学术 2024-10-29 16:00 上海

撰文│黄伟健鄢和新

编辑│毕紫娟

审校│汤红明

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肝脏具有巨大的再生潜能，当其遭受持续慢性损伤时大量胆管上皮样细胞被激活，并从汇管周围逐步扩增到附近的肝实质组织，这一过程被称为胆管反应（ductular reaction，DR）。研究表明，这群伴随DR活化的细胞同时表达部分肝胆功能的标志物，是具有肝胆双向分化潜能的肝前体细胞（liver progenitor like cells，LPCs）。由于发病机制复杂，且缺乏有效治疗方案，慢性肝病将逐步恶化为终末期肝病。肝移植是目前能有效治疗终末期肝病的唯一手段，然而肝脏供体数量远未能满足病患需求，因此国内外研究团队希望通过阐明这群大量激活的LPCs对慢性肝损伤的作用和影响，开创全新且有效的细胞治疗手段，以改善乃至逆转慢性肝病进程。

一、慢性肝脏损伤伴随LPCs活化

正常肝细胞的自我更新通常由邻近肝细胞分裂增殖或自我复制而来。然而持续的长期慢性损伤（病毒性肝炎、代谢性肝病、酒精性肝病等不同病因引起的肝硬化过程）将严重损伤肝细胞的再生功能；此外激活 “胆管上皮样细胞增殖或者化生” 这一再生修复途径也加剧了肝损伤。美国Popper等研究者将这一以肝脏损伤诱导的胆管上皮样细胞表型激活反应为特征的现象命名为DR。后续研究发现该损伤活化细胞具有肝胆系双重特征，可被不同LPCs标志物标记，包括EpCAM、SOX9、OV6、A6、CD24、CD133、NGA2和CXCR4 等，因而普遍认为其具有LPCs的生物学特性。然而胆管反应中LPCs的起源、命运转归及其对肝脏再生修复的作用仍未清楚。

不论何种病因的肝脏疾病，在无急性诱因的情况下，进入慢性病程后一般经历肝炎、肝纤维化、肝硬化的病理发展阶段。据统计全球目前有1.12亿的肝硬化患者（代偿性肝硬化的年龄标准化全球患病率为1395例/10万人），而35%的肝硬化患者将进展为肝功能衰竭等终末期肝病，严重危及患者生命健康。肝移植作为唯一可靠的延长终末期肝病患者生命的治疗方法，由于供体数量不足，亟须替代治疗方案。鉴于DR在慢性肝病中普遍存在，部分研究结果表明DR中被激活的LPCs可能是受损肝脏中补充肝实质细胞的可靠来源。因此，进一步探讨被激活的LPCs在肝再生中的命运转归及对肝脏再生修复作用，有助于为晚期肝病患者提供潜在的治疗方案。

二、慢性肝病中LPCs的可能来源与功能

处于发育过程中的肝脏存在LPCs，并被命名为肝母细胞（hepatoblasts）。肝脏由肝母细胞形成肝芽，并逐步定向分化为肝细胞和胆管上皮细胞。在人胎儿肝脏样本中，发现CD117⁺CD34⁺CD90^-细胞亚群在体外表达肝细胞和胆管上皮细胞标志物；其他研究团队则鉴定了类似具有增殖潜能的细胞可表达CD133、CK8、CK18、CK19、CD44H、telomerase（端粒酶）、claudin 3、Alb（Albumin，白蛋白）等标志物。这些细胞在培养过程中显示出强大的克隆增殖能力，并可分化为脂肪、骨、软骨和内皮细胞。乙酰氨基酚（APAP）致死模型研究证明了在成体肝脏的Hering小管中存在表达LPCs标志物的细胞亚群，且管内含有可作为培养物的层粘连蛋白的基底膜，即Hering小管具备了干细胞小室的特性特征，对LPCs的增殖和干性维持起重要作用，并在体内肝损伤过程中具有包裹和保护LPCs的功能。

肝脏再生能力非常强，这体现在严重肝损伤过程中肝细胞和胆管上皮细胞本身也可转化为LPCs。一些研究团队观察到CDE损伤模型（严重受损肝细胞增殖能力，刺激胆管反应），被激活而大量扩增的LPCs可能是胆管上皮细胞来源。Oertel课题组的一项研究，先通过AAV8-TBG-Cre对小鼠肝细胞特异性标记增强YFP（enhanced YFP，eYFP），同时进行肝细胞β-catenin基因表达敲除（eYFP⁺β-catenin^-hepatocytes），并构建CDE损伤模型。有趣的是，CDE损伤停止2周后，eYFP^-β-catenin⁺hepatocytes明显增多；而在CDE损伤停止的3～7天，观察到β-catenin⁺LPCs同时表达CK19和Hnf4α，表明它们可能是正在分化为肝细胞的胆管上皮细胞。其他用于标记CDE损伤的谱系追踪模型包括OPN^CreERT2、Foxl1^CreERT2、Hnf1^CreERT2和CK19^CreERT2。而在这些研究中，LPCs衍生的肝细胞比例为1.86%～2.45%。谢渭芬教授团队通过观察TAA长期诱导的严重慢性肝损伤模型，发现胆管上皮细胞可转化为CK19和HNF4α阳性的具有分化潜能的前体细胞，并在损伤停止后分化为肝细胞。总之，这些结果表明，当肝细胞增殖遭到长期严重损伤时，胆管上皮细胞来源的LPCs可被激活并转化为肝细胞，恢复受损肝脏功能。

此外，特殊的肝细胞亚群可转分化为胆管上皮样细胞，从而促进肝脏再生修复，这一理论在两种嵌合鼠损伤模型中得到了证实：① 来自WCBowen团队的DPPIV⁺肝细胞和DPPIV^-胆管上皮细胞的嵌合大鼠模型（DPPIV^-大鼠给予阻断肝细胞增殖的药物retrorsine再进行DPPIV⁺肝细胞移植得到嵌合肝脏）进行胆管结扎损伤后，观察到DPPIV⁺胆管上皮细胞出现；② 来自Markus Grompe团队的Tomato⁺Fah⁺肝细胞和Fah^-胆管上皮细胞的嵌合小鼠模型（Fah^-小鼠进行Fah⁺mTmG肝细胞移植得到的嵌合肝脏）进行DDC损伤后发现了Tomato⁺Fah⁺胆管上皮细胞。有趣的是，惠利健教授团队2019年发表在Cell Stem Cell 中的工作证明，肝细胞具有重编程能力的内在特性是受到Arid1a调控，Arid1a预先开放了成熟肝细胞中重编程相关基因（rerogramming related genes，RRG）的染色质，从而使得成熟肝细胞可以响应损伤信号发生重编程转化为LPCs；进一步于2023年最新工作中揭示肝脏损伤下，驻留Kupffer细胞分泌的炎症信号IL-6通过肝细胞表达的受体IL6R/gp130直接激活肝细胞STAT3信号通路，结合到受Arid1a调控重编程相关基因的位点，开放的染色质区域，从而诱导肝细胞去分化并促进了肝前体基因的表达（Sox9⁺ LPCs ）。尽管上述3种细胞都可能转化为肝前体细胞参与肝脏修复，由于肝细胞数量多并具有异质性，更容易在受损状态转化为LPCs，因此，肝细胞来源的LPCs在慢性肝损伤修复中更具有重要作用和临床应用价值。

三、慢性肝病中LPCs的活化机制与体外应用

许多信号转导通路都参与LPCs的激活和增殖过程，包括Wnt/β-catenin、Notch、TGFβ、IL6-Stat3、Hippo等，其中Wnt/β-catenin通路参与调控LPCs激活和增殖分化的整个过程。Monga等研究者发现在DDC诱导肝损伤时，LPCs的激活伴有β-catenin及其靶基因转录活性的明显上调；王红阳院士团队研究成果表明，特异性激活Wnt通路后OV6⁺细胞群出现明显的富集现象并表现出较强的自我更新能力，高度表达一些具有 “干细胞性的基因”（Na nog、Oct4等）。而Notch信号不仅是胆管分化的重要调节分子，周斌研究团队将单细胞RNA测序与双重组酶介导的谱系追踪和途径调节相结合，揭示了Notch信号通路调控胆管上皮细胞向LPCs转分化的过程。Ben Z Stanger团队发现TGF-β可通过Smad4促进或抑制LPCs往胆管上皮细胞分化。Jan S Tchorz等研究者发现胆管结扎损伤后的YAP基因敲除小鼠显示DR显著下降，表明DR与Hippo-YAP信号通路有关；另外Xiaobo Cai等研究者发现肝细胞特异性YAP过表达可诱导LPCs标志物（包括CK19、SOX9 和A6）的表达升高。众多研究明确了Notch信号通路是体内YAP的功能性靶点，表明通过激活Notch信号通路，Hippo-YAP信号通路能与DR和肝细胞转分化成胆管细胞产生联系。

进一步可以通过小分子组合模拟和调控多种肝再生信号通路，促进肝前体细胞体外活化增殖过程，如A83-01（TGF-β信号通路的抑制剂）、CHIR99021（GSK3β抑制剂，可激活Wnt/β-catenin信号通路）、Y-27632（ROCK抑制剂，可防止细胞凋亡并促进细胞增殖）等。笔者团队通过在小鼠体内注射小分子组合（HGF、Y-27632、A-83-01和CHIR99021）可诱导肝细胞转化为LPCs以改善肝脏纤维化程度；此外，谢欣教授团队使用Y-27632和CHIR99021可促进移植肝细胞去分化为LPCs，并加速移植肝细胞的体内增殖。在体外培养方面，笔者与国内外众多研究团队（包括惠利健教授、胡惠丽教授、Takahiro Ochiya 等研究者）发现，通过这些小分子组合可将小鼠和人的原代肝细胞、胆管上皮细胞及肝干细胞在体外转化为具有规模化扩增能力的肝前体样细胞（hepatocyte derived-liver progenitor like cells，HepLPCs）。其中肝细胞来源的HepLPCs除具有增殖能力外，同时具有分化为成熟肝细胞的潜能，有效定植于Fah^-小鼠并恢复其受损的肝脏功能。

四、LPCs在慢性肝损伤中的研究探讨

美国食品和药物管理局（FDA）目前尚无批准用于治疗肝纤维化的药物，是否可以通过LPCs移植治疗肝纤维化/肝硬化，成为研究的热点。Sharma和周伟杰教授团队均发现Lgr5⁺肝前体细胞移植到CCl₄和DDC小鼠肝纤维化模型中，可明显缓解小鼠体内纤维化进程；相反，若敲减小鼠中肝前体细胞Lgr5的表达，肝纤维化将进一步加重。同时Stuart J Forbes团队发现通过体外分离扩增CD24⁺肝前体细胞并回输慢性纤维化肝脏，不但可以补充肝实质细胞，更能有效缓解肝脏纤维化进程，这提示CD24⁺ HepLPCs可能也具有相似的缓解肝纤维化乃至肝硬化的作用，笔者团队通过CCl₄小鼠纤维化模型进一步验证了这一假说。那么这种肝前体/干细胞是否可应用于肝硬化患者，起到延缓乃至逆转肝硬化的效果呢？来自比利时Promethera Bioscience 公司开展的通过肝干细胞（human liver stem cells，HLSC ；商品名HepaStem^®）治疗酒精性肝硬化的Ⅱ期临床研究（EudraCT 2016-001177-32）尝试回答这个问题。结果显示，输注后受试者的Child评分有下降，且有统计学差异（P＜0.05），显示输注后肝脏功能恢复，且随后3个月随访中受试者生存率有提高，且无肝衰竭再发。

在一系列研究基础上，为了进一步明确HepLPCs对肝硬化治疗的安全性和有效性，笔者团队按照细胞治疗产品药学指导原则和要求，优化体外小分子培养扩增体系，在GMP条件下制备了临床级细胞注射液——HepLPCs，并于2021年12月在上海交通大学医学院附属仁济医院开展了全球首个同种异体肝细胞移植治疗肝硬化的安全性和耐受性临床研究。截至2023年9月，顺利完成全部剂量组受试者的入组和随访工作，未发生任何与细胞治疗相关的不良反应，显示HepLPCs这一细胞治疗方案具有良好的安全性和耐受性，并初步展示了应用于肝硬化治疗的潜在有效性。

五、总结与展望

细胞移植被认为是一种治疗肝硬化的有效手段，但部分细胞的应用存在争议，治疗形式较为单一，而且尚无十分明确的作用机制及治疗靶点。前期笔者所在团队通过小分子重编程技术实现了原代肝细胞转化为可在体外高效扩增的HepLPCs，并分别在临床前动物模型和肝硬化患者中明确了HepLPCs是一种有效治疗肝硬化的崭新LPCs，丰富了应对失代偿期肝硬化乃至肝衰竭的细胞来源。然而目前不同来源的细胞治疗肝硬化的机制仍未被阐明清楚，且不同供体来源可能存在较大的疗效差异。因此需要进一步通过转录组、蛋白组、代谢组等多组学结合探明不同细胞在抗纤维化和促进肝再生中的有效靶点及效应蛋白，从而实现细胞的功能加强，以最终治愈终末期肝病。

（ID:yxckbsc2024040101）

作者简介

鄢和新研究员

现任上海交通大学医学院附属仁济医院麻醉科研究员，博士研究生导师，上海市东方学者特聘教授，国家重点研发计划首席科学家。在肝病领域，带领研发团队于国际上率先建立和鉴定了“可诱导前体样细胞（induced progenitor-like cells，iPLC）”的细胞类型，开创了通过iPLC激活机体“发育性再生”以促进组织再生修复的再生医学新理念，并将该平台技术成功应用于肝脏科学研究和细胞治疗。以通信作者或第一作者在Science Translational Medicine、 Cell Research、Journal of Hepatology 等杂志发表论文30篇，总影响因子280分，被引用超过2000次。主持“十三五”国家重点研发计划课题、国家863计划专题课题、国家自然科学基金项目多项。以第二完成人获得国家自然科学二等奖、教育部科技进步奖一等奖，并荣获首届“浦东新区科技精英”等荣誉。

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