干细胞检测（四）| 探索干细胞生物学有效性

学术 2024-12-20 16:00 上海

撰文│朱邯豫齐奕尧

编辑│毕紫娟

审校│汤红明

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组稿策划人

白志慧

上海市东方医院（同济大学附属东方医院）干细胞基地GMP实验室副主任兼质检部主任

担任上海市东方医院人体细胞临床研究伦理委员会委员、中国整形美容协会干细胞研究与应用分会第二届理事会理事，以及全国生化检测标准化技术委员会细胞检测工作组的成员，长期从事干细胞质量检测与管理工作，组织通过CNAS ISO/IEC 17025认可，为8项国家备案的干细胞临床研究项目提供质检和放行检验服务，推进3项干细胞药品申报，获2项IND批件。申请3项发明专利，授权1项，发表7篇论文（含2篇SCI），参与制定1项行业标准和4项国家标准。

干细胞技术在再生医学和细胞治疗领域展现了巨大的应用潜力。为了确保干细胞产品的安全性、有效性和质量稳定，必须经过一系列严谨的检测和控制。干细胞关键检测内容包括基本生物学属性、生物学安全性、微生物学安全性、生物学有效性、理化检测和残留检测。

基本生物学属性检测：基本生物学属性检测是干细胞产品质量评估的基础，涵盖细胞活率、群体倍增时间、细胞周期等。通过这些检测，研究人员可以确保干细胞在治疗应用中的活性和功能不受影响，保证其在临床治疗中的有效性。

生物学安全性检测：干细胞产品在临床应用中的生物安全性至关重要。生物学安全性检测包括基因突变、肿瘤形成风险和免疫反应评估。通过成瘤性和遗传稳定性检测，可以确保干细胞在体内不会引发恶性变化或其他安全隐患。

微生物学安全性检测：为了防止干细胞产品在生产和储存过程中受到微生物的污染，必须进行严格的微生物学安全性检测。无菌检测、支原体检测、病毒检测有助于确保干细胞制剂不含病原微生物，确保其在临床应用中的安全性。

生物学有效性检测：干细胞产品的生物学效力试验是确保其在临床应用中发挥预期疗效的重要检测手段。通过分化能力、免疫调节功能等的评估，研究人员能够验证干细胞的治疗潜力，并为其在疾病治疗中的应用提供科学支持。

理化检测：理化检测主要针对干细胞产品的外观、pH值、渗透压等物理化学特性进行评估。这些指标对于产品的质量一致性和安全性至关重要。例如，干细胞制剂的渗透压必须符合人体的生理条件，以避免临床使用过程中引发不良反应。此外，可见异物的检测有助于排除产品中潜在的物理污染物，确保产品在使用过程中的安全性。

残留检测：干细胞产品的残留检测旨在确保制剂中的外来物质，如培养过程中使用的消化酶、冻存液等，未对产品的质量和安全性造成影响。常见检测项目包括DMSO（冷冻保护剂）残留检测、病毒残留检测等。这类检测能够避免潜在的毒性反应或免疫反应，确保制剂的纯度和安全。

【编者按】本公众号邀请了东方医院干细胞基地GMP实验室的白志慧副主任组稿了干细胞检测的系列文章，将分6期推出并详细为大家介绍。第一期推出了《干细胞检测（一）｜了解干细胞产品质量的秘密：基本生物学属性检测》，第二期推出了《干细胞检测（二）｜干细胞应用的生物学安全性》，第三期推出了《干细胞检测（三）｜干细胞微生物学安全性检测》，本期推送干细胞检测系列文章的第四篇：干细胞检测（四）| 探索干细胞生物学有效性。确保干细胞制剂的有效性和质量可控性是其临床转化的关键，本文详细介绍了生物学有效性相关的检测项目，并强调了这些检测项目在干细胞临床转化中的重要作用。

一、干细胞生物学有效性检测的重要性

保障干细胞制剂的安全性与质量

干细胞生物学有效性检测对于确保干细胞制剂的安全性和质量至关重要。通过对干细胞的行为和功能进行评估，以保障其在临床转化中的安全性，对于实现干细胞制剂的质量可控至关重要，有助于干细胞产品的标准化和规模化生产，确保干细胞治疗的可靠性和一致性。

连接基础研究与临床转化的桥梁

生物学有效性检测是评估干细胞功能和质量的重要手段，也是连接干细胞基础研究与临床转化的关键桥梁。通过全面的检测，可以深入揭示干细胞的分化机制、修复功能和免疫调节特性，为干细胞在临床中的安全性和有效性提供重要的科学依据和技术指导。此外，这些检测能够验证干细胞在不同应用场景下的稳定性、可控性及与宿主环境的相容性，从而为干细胞研究成果的临床转化奠定基础。生物学有效性检测在确保干细胞治疗的安全性、有效性及规范化应用方面具有不可或缺的作用。

二、生物学有效性检测项目

间充质干细胞

分化功能：成脂、成骨、成软骨分化检测

成脂、成骨、成软骨分化检测是评估干细胞多向分化潜能的重要实验，对验证干细胞在特定条件下诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞的能力至关重要。这些检测不仅涉及细胞形态学观察，还包括特定基因和蛋白的表达分析，确保分化过程的准确性和效率。通过这些检测，研究人员可以深入理解干细胞分化机制，为临床转化提供科学依据。例如，成骨分化过程中，细胞会合成及分泌有机基质，形成类骨质，其特征物是碱性磷酸酶，这是成骨细胞分化成熟的早期标志；而长时间的成骨诱导会使钙离子以钙盐方式沉淀下来，形成“骨结节”，这是通过茜素红染色来鉴定；成脂分化则涉及到细胞内脂肪滴的积累，通常通过油红O染色后在显微镜下呈现红色来鉴定。

免疫调节功能检测

BV2细胞增殖抑制和PBMC细胞增殖抑制检测是评估间充质干细胞免疫抑制功能的重要实验。因PBMC涉及不同供者可能会导致实验结果不稳定，以及该细胞不具传代性，不可持续使用，可考虑使用BV2细胞系进行检测。BV2细胞为小胶质细胞系，其在神经炎症和免疫调节中扮演着关键角色。BV2细胞增殖抑制检测通过间充质干细胞或其旁泌物与BV2细胞共培养后，利用CCK8试剂盒检测共培养后的BV2细胞活性，计算BV2细胞存活率。间充质干细胞除了抑制淋巴细胞增殖外，还能调节淋巴细胞亚群分化，这也是免疫调节功能方面必需的检测内容。间充质干细胞能够通过分泌细胞因子，调节Treg和Th17细胞的增殖和分化。淋巴细胞亚群检测是评估细胞免疫和体液免疫功能的重要指标，包括T细胞（CD3+）、B细胞（CD19+）和NK细胞（CD3-CD16+CD56+）。通过这些检测，可以更全面地评估间充质干细胞的免疫调节功能，包括其对炎症的调节作用及对淋巴细胞亚群分化的影响，从而为临床转化提供科学依据。

组织修复功能：促血管形成实验

间充质干细胞在组织修复和再生中扮演着重要角色，特别是在促进血管生成方面。促血管形成实验主要是为了评估干细胞促进新血管形成的能力，这对于组织修复和伤口愈合至关重要。干细胞能够分泌多种促血管生成因子，如血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）和转化生长因子β（TGF-β）。这些因子能够刺激血管内皮细胞的增殖和迁移，从而促进新血管的形成。在体外实验中，可以通过培养干细胞并分析其分泌的血管生成因子的水平来评估其促血管形成能力。此外，还可以通过促血管形成实验，来直接观察干细胞对血管网络形成的影响。

细胞因子检测

细胞因子检测是评估间充质干细胞治疗机制和功能的重要手段。常用的检测方法：ELISA（酶联免疫吸附试验），是一种单指标检测技术，可以定量检测特定细胞因子的水平。它基于双抗体夹心法或直接法，具有较高的特异性和灵敏度，通常在1~100 pg/mL之间。细胞因子检测关键指标涵盖衰老、炎症和心衰相关因子。衰老相关因子包括p16、p21、γH2AX及SASP中的IL-6、IL-8；炎症因子有IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及IFN-γ；心衰相关因子包括BNP/NT-proBNP、sST2、Gal-3及IL-18。细胞因子检测不仅是基础免疫研究的有效手段，同时，也为临床诊断和治疗提供了重要的生物标志物。随着研究的不断深入，将会有更多新的细胞因子指标被发现并纳入评估体系中，进一步丰富和完善细胞因子检测的内涵与价值。

诱导多能干细胞类

体外三胚层分化检测

三胚层分化检测覆盖了全能、多能、多潜能干细胞，可在体外诱导分化为内胚层（如肝细胞、胰腺细胞）、中胚层（如心肌细胞、血管内皮细胞）及外胚层（如神经细胞、皮肤细胞）的能力。这些检测有助于研究人员深入理解干细胞在模拟胚胎发育过程中的作用，为再生医学提供重要的实验数据。例如，iPSC在多种细胞因子相互作用下，可分化形成内、中、外三个胚层，进而可以体外模拟人胚发育，构建模拟标准化的人体细胞、组织和器官。

畸胎瘤形成检测

多能、全能干细胞有形成畸胎瘤的风险，成熟畸胎瘤包括所有人体三个胚层的结构，分为内、中、外胚层组织。其中，外胚层最常见的是皮肤、脑和脉络丛，中胚层包括软骨、骨、脂肪和肌肉（包括平滑肌和横纹肌），内胚层包括囊状排列的呼吸或消化器官的上皮，同时可见胰腺、肝脏组织等，畸胎瘤形成检测可以评估干细胞的干性及分化效能。

拟胚胎形成实验

拟胚胎形成实验是评估诱导多能干细胞多能性和分化潜能的关键实验，通过模拟胚胎发育，使iPSC在无bFGF条件下形成聚集体，这些聚集体在7-21天内分化为代表三个胚层的细胞类型。实验过程包括悬浮培养以形成EBs，随后转移并贴壁培养以促进进一步分化。分析方法包括免疫细胞化学，以检测分化标志物如SMA（中胚层）、AFP（内胚层）及TUBB3/TUJ1（外胚层）。拟胚胎形成实验有助于研究干细胞分化机制，为再生医学提供实验数据，理解干细胞发育潜能，指导临床转化。

其他类细胞（如神经干细胞、心肌细胞、胰岛细胞等的功能检测）

神经干细胞（NSC）功能检测主要是评估其形态学特征、特异性抗原表达及分化潜能。NSC在悬浮培养中形成聚球，表达巢蛋白（Nestin）等分子标志物，并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

心肌细胞功能检测则侧重于电生理特性和收缩功能，利用Patch Clamp技术检测离子通道功能和动作电位，以及通过Plexithermo HCell系统分析收缩功能。这些检测有助于评估心肌细胞模型的电生理特性和收缩能力。

胰岛细胞功能检测主要评估其分泌胰岛素的能力，包括胰岛素分泌测试和C肽测定。胰岛素分泌测试通过检测胰岛细胞在葡萄糖刺激后分泌胰岛素的水平来评估其功能，而C肽测定则利用C肽与胰岛素原的关系，评估胰岛细胞的功能。C肽半衰期较长，适合用于评估胰岛细胞功能。

三、总结

通过生物学有效性检测，可以全面评估干细胞制剂的安全性、有效性及质量可控性，这是推动干细胞治疗技术从实验室走向临床的关键步骤。生物学有效性检测不仅能够验证干细胞的分化潜能、功能特性及免疫调节能力，还为干细胞制剂的生产工艺和应用标准提供科学依据，确保其在临床治中的可重复性和可靠性。随着科技的不断进步，研究人员对干细胞的分化机制、信号调控网络及临床适用性有了更深入的认识，为再生医学和组织工程的创新发展开辟了新的可能性。未来，期待全球科研工作者和医疗专家通力合作，通过规范化的技术研发和临床实践，共同推动干细胞技术的安全应用和产业化发展，为患者带来更高效、更安全的精准治疗方案。

撰稿作者简介

朱邯豫

现任国家干细胞转化资源库、上海市东方医院（同济大学附属东方医院）干细胞基地GMP实验室质检员，负责干细胞规模化生产质量检验技术开发、验证和质量标准制定；持有特种设备作业证书、安全生产管理人员证书。获授权干细胞相关发明专利2项。作为技术骨干，参与上海市卫生计生委协同创新集群计划“重大疾病的干细胞治疗研发与临床转化体系建立”、2020年国家重点研发计划“干细胞治疗产品的规范化与规模化生产及质量评价研究 ”子课题、上海市教委“干细胞与转化”高峰学科、上海市科学技术委员会上海市专业技术服务平台“干细胞制备与检测平台”等项目的申报及科研管理工作。

现任

审稿人 徐国东

现任武汉珈创生物技术股份有限公司研发总监，微生物学博士，高级工程师。多年来专注于生物制品质量研究，在细胞质量控制领域积累了丰富的经验。发表SCI论文5篇，授权发明专利17项。主持多项省市科研项目，先后获得湖北省科技进步二等奖、湖北省科技成果推广三等奖、光谷3551创新人才。

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干细胞基地管理文章合集

【01】加强干细胞临床研究质量控制的策略探讨

【02】关于推进干细胞临床研究的若干思考

【03】医疗机构干细胞临床研究学术委员会建设现状与对策思考

【04】我国干细胞研究的伦理学问题及对策探讨

【05】双备案制度下干细胞临床研究角色职责的转变及应对策略

【06】关于推进干细胞产业化的思考——以医疗机构和企业为视角

【07】加强干细胞科技成果转化的策略探讨