“现货型”iPSC-NK细胞何时能上药品货架

撰文│陈献威

编辑│毕紫娟

审校│汤红明

尽管CAR-T细胞疗法十分有效，但是其发展也面临诸多挑战。

► 安全风险较高

CAR-T细胞激活会发生炎症细胞因子的大量释放，从而导致细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）和神经毒性等；在CAR-T细胞疗法（Kymriah）治疗复发或难治性急性淋巴细胞白血病（ALL）的Ⅰ期临床试验中，85%的患者出现CRS，其中26%的患者出现3级或更高毒性，41.5%的患者出现3级或更高神经毒性，其他CAR-T疗法也观察到了类似的CRS和神经毒性。

► 治疗费用高

根据披露的信息，CAR-T细胞疗法在美国和中国的单次治疗费用分别高达约40万美元和约120万元人民币，高额的费用使得多数肿瘤患者根本用不起CAR-T细胞疗法。

► T细胞来源受限

由于同种异体反应和移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD），CAR-T细胞疗法需要使用患者自体T细胞，然而大约22.5%患者不能提供足够的T细胞；由于CAR-T细胞的制备复杂且漫长（一般2～4周），许多患者在等待过程中出现病情恶化；细胞来源问题也严重限制了CAR-T细胞疗法的适用范围。

► 肿瘤特异性抗原稀缺

CAR-T细胞对肿瘤的识别主要依赖肿瘤特异性抗原，最为理想的抗原是仅在肿瘤细胞表达，在正常细胞中不表达，然而这样的肿瘤特异性抗原十分罕见，这也严重限制了CAR-T细胞在肿瘤治疗（尤其是实体瘤）中的应用。

因此，尽管CAR-T细胞疗法在癌症治疗方面取得了重大进展，但仍然需要进一步研究和创新来解决这些挑战，提高CAR-T细胞疗法的治疗效果，扩大其在临床实践中的应用。

自然杀伤细胞（natural killer cells）简称NK细胞，是一种对先天免疫系统至关重要的细胞毒性淋巴细胞，占人类所有循环淋巴细胞的5%～20%。NK细胞的活化受到多种激活性和抑制性受体的严格调控，活化的NK细胞通过释放穿孔素、颗粒酶及IFN-γ等细胞因子对靶细胞造成杀伤。NK细胞不同于T细胞和B细胞，是一类无须预先致敏就能杀伤癌细胞、病毒或细菌感染的细胞。目前，正在积极探索NK细胞作为过继性细胞疗法的替代方法。尽管NK细胞在细胞毒性和体内持久性等方面有待进一步提升，与CAR-T细胞疗法相比，CAR-NK细胞疗法在安全性、细胞来源、异体治疗等多方面具有显著优势。

► CAR-NK细胞疗法具有更好的安全性

在许多CAR-NK细胞疗法的临床试验中均未观察到明显的CRS和神经毒性。CAR-T细胞激活导致炎症细胞因子的大量释放，例如TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-6等，而接受CAR-NK治疗的患者此类炎症细胞因子并未显著增加。NK细胞与T细胞激活时会释放不同细胞因子，这可能是CAR-NK细胞疗法不会导致CRS和神经毒性的重要原因。

►CAR-NK细胞疗法适用于异体治疗和开发“现货型”（off-the-shelf）过继性细胞疗法

与T细胞识别主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex, MHC）上呈递的抗原不同，NK细胞可以在没有MHC的情况下直接识别靶细胞。事实上，MHC与NK细胞的杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killer cell immunoglobulin-like receptors，KIR）结合会抑制NK细胞功能。因此，异体治疗可以增加NK细胞的细胞毒性。由于CAR-NK细胞疗法适用于自体和异体治疗，其细胞来源也更加多样化。除了可以采用自体或异体外周血NK细胞（PB-NK）之外，还可以使用脐带血NK细胞（CB-NK）、NK92细胞系、诱导多能干细胞（iPSC）来源的NK细胞（ iPSC-NK）等。CAR-NK细胞疗法的一个重要优势是开发“现货型”细胞疗法，做成货架上的药品，可以随时输注给患者，极大缩短患者的等待时间。

此外，iPSC-NK细胞非常适用于开发“现货型”细胞疗法。由于从供体获得的PB-NK和CB-NK数量不足以用于过继性细胞疗法，首先需要进行体外大量扩增。通过将NK细胞与滋养层细胞（k562-mbIL21-41BBL细胞）共培养，在IL-2或IL-15的刺激条件下可实现NK细胞的大量扩增，以获得足够的NK细胞用于过继性细胞疗法。除了细胞数量有限且需要体外扩增之外，PB-NK和CB-NK的不足之处还在于不同供体来源的NK细胞存在差异，有混杂T细胞造成安全风险的可能。NK-92细胞是永生化细胞系，来自非霍奇金淋巴瘤患者，具有抗肿瘤和无限增殖的优势。其主要缺点是具有致瘤性，必须在过继性细胞疗法之前对其进行辐照，以抑制它们在患者体内的增殖。NK-92细胞不表达CD16，这会抑制NK细胞抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cellmediated cytotoxicity，ADCC）。由于iPSC具有无限增殖和易于基因编辑的特性，iPSC-NK细胞可以很好地解决上述NK细胞来源不足的问题，以提供足量的、同质性较好的、CD16阳性的、抗肿瘤的iPSC-NK细胞，非常适用“现货型”NK细胞疗法的开发。

NK细胞具有不依赖CAR的天然靶向和杀伤癌细胞的能力。除了表达CAR基因之外，NK细胞还有多种靶向和消除癌细胞的机制。NK细胞的活化受到激活性受体（比如NKG2D、CD16、NKp46等）和抑制性受体（比如NKG2A、KIRs等）的调控。通过基因编辑手段（提高激活性受体的表达或降低抑制性受体的表达）等策略，增强NK细胞靶向和杀伤肿瘤细胞的能力。NK细胞通过其细胞表面的CD16介导ADCC，识别肿瘤细胞上结合的IgG的Fc部分并杀死癌细胞。因此，也可以通过增强CD16的膜表达，提高NK细胞靶向和杀伤癌细胞的能力。这些增强NK细胞靶向和杀伤癌细胞的策略往往需要用到基因编辑技术，与患者和健康供体来源的NK细胞相比，iPSC-NK细胞在基因编辑方面具有显著优势。因此，从基因编辑的角度考虑，iPSC-NK细胞也非常适用于“ 现货型”CAR-NK细胞疗法的研发。

鉴于iPSC-NK细胞的诸多优势，开发“现货型”iPSC-NK细胞疗法已经成为过继性细胞疗法研究的一个热点方向。提高iPSC向NK细胞分化的效率，建立适合大规模生产的分化方法，以获得足够的、功能性的NK细胞，是相关研究的重点。

iPSC-NK细胞的分化主要分为两个步骤：

（1）将iPSC诱导分化成CD34阳性/CD45阳性的造血干细胞（HSC）；

为了更好对接临床转化，在HSC和NK细胞的分化过程中应尽量避免使用滋养层细胞、含动物血清的培养基、转基因技术等，简化分化流程，降低成本，规避潜在的安全风险。随着干细胞技术的快速发展，诱导iPSC向NK细胞定向分化的方法也日渐成熟。

HSC的分化方法及主要挑战。在含有SCF、BMP4、VEGF、bFGF等生长因子的分化培养基中培养iPSC，可以将其定向分化成HSC，该方法分化获得的HSC适用于红细胞、巨噬细胞等髓系细胞的分化。为了获得适用于NK细胞等淋系细胞分化的HSC，研究者通常通过悬浮培养iPSC形成拟胚体（embryoid bodies，EB），在含有SCF、BMP4、VEGF、bFGF等生长因子的分化培养基中培养EB，可以在EB内部分化出CD34阳性/CD45阳性的HSC。美国加州大学Kaufman实验室在iPSC-NK细胞相关研究中取得了卓越的成绩，其建立“spin-EB”法在NK细胞分化相关的研究中得到了广泛应用。然而，现有HSC分化方法尚有一些不足之处，主要包括分化效率低且不稳定，分化出的HSC存在于EB内部，不利于后续NK细胞的分化等。由于HSC的分化是限制iPSC-NK细胞规模化生产的关键步骤，因此，优化HSC的分化方法并提高其效率和产量，是开发“现货型”iPSC-NK细胞疗法的重要研究内容。

iPSC-NK细胞的分化及主要挑战。在含有SCF、FLT3L、IL-3、IL-15、IL-17等生长因子和细胞因子的分化培养基中培养HSC，可以在约3周内将其分化成CD56阳性/CD3阴性的NK细胞，并且占比可达95%以上。iPSC-NK细胞不仅表达激活性和抑制性表面受体，比如CD16、NKG2D、NKp46、NKG2A等，还可以通过释放穿孔素、颗粒酶、IFN-γ等对肿瘤细胞造成有效杀伤，说明iPSC-NK细胞是具有功能性的。iPSC-NK细胞的重要优势是可以为“现货型”NK细胞疗法提供充足的细胞。然而，目前iPSC-NK细胞在被用于临床前和临床研究之前仍需要进行体外扩增以获得足够细胞。中国科学院动物研究所王金勇团队建立了无EB的类器官聚集方法，可以在约4周时间内将iPSC分化成大量NK细胞，且不需要扩增NK细胞的滋养层细胞。只是该方法使用了来自小鼠的OP9滋养层细胞，不利于成果转化。这提示，现有的iPSC-NK细胞分化效率和产量仍需要大幅提升和优化，以满足“现货型”NK细胞疗法的转化需求。

目前，肿瘤的CAR-NK细胞疗法尚未获批上市，相关研究仍在临床及临床前的研究阶段，iPSC-CAR-NK细胞疗法也同样处于临床及临床前研究的早期阶段。美国加州大学Kaufman实验室不仅在iPSC-NK细胞分化方面成果卓越，其在肿瘤的iPSC-CAR-NK细胞疗法研究中也走在了世界前列，该实验室近几年相继发表了多篇有关iPSC-NK细胞疗法的高质量研究论文，先后证明了在iPSC-NK细胞中表达NK-CAR（scFV-NKG2D-2B4-CD3），高亲和力不可切割的CD16（high-affinity and noncleavable CD16，hnCD16），或者敲除cish基因，均可以显著增强iPSC-NK细胞的抗肿瘤能力，并且敲除cish基因还可以显著提高iPSC-NK细胞的体内持久性。在国内，近期有关iPSC-NK细胞疗法的研究也取得了重要突破。北京大学李扬团队和北京大学人民医院赵翔宇团队等合作构建了NK细胞特异性hnCD16融合受体（hnCD16FR），并证明了hnCD16FR-iPSC-NK细胞结合CD20单抗可以显著提高iPSC-NK细胞的抗肿瘤能力。中国科学院动物研究所王金勇团队建立了无EB的类器官聚集方法，将iPSC诱导分化成NK细胞，并证明了采用该方法获得的iPSC-NK细胞具有显著的抗肿瘤能力。随着iPSC-NK细胞疗法的快速发展与不断创新，有望进一步提升其抗肿瘤的能力及其体内持久性，为后续临床转化提供有力支撑。

在采用iPSC来源的NK细胞治疗肿瘤的临床试验方面，目前已有多款iPSC-NK细胞疗法进入临床Ⅰ期试验，主要来自Fate Therapeutics、Century Therapeutics、启函生物等公司。Fate Therapeutics是iPSC-NK细胞疗法的明星公司，先后有多款“现货型”iPSC-NK细胞产品进入临床试验，包括FT500、FT516、FT536等，对应的适应证分别为晚期实体瘤、COVID-19、复发性妇科癌症等。Century Therapeutics紧随其后，其iPSC来源的“现货型”iPSC-CAR-NK细胞产品CNTY-101也于去年早些时候进入临床试验，用于治疗复发或难治性CD19阳性B细胞淋巴瘤患者。近两年，国内在推进“现货型”NK细胞疗法临床试验方面也取得了重大突破。启函生物的CD19 iPSC-CAR-NK 细胞（QN-019a）已于去年进入临床Ⅰ期试验，用于治疗CD19阳性的复发难治性侵袭性B细胞非霍奇金淋巴瘤。近期这些临床和临床前试验的突破性进展，说明“现货型”iPSC-NK细胞疗法将成为肿瘤过继性细胞疗法的重点发展方向。

CAR-T细胞疗法的成功为肿瘤治疗指明了新方向。随着了解的深入，研究人员意识到CAR-T细胞疗法虽然有效，但其发展面临诸多挑战，包括安全风险高、治疗费用高、细胞来源受限、肿瘤特异性抗原靶点稀缺等。NK细胞可以天然杀伤肿瘤细胞，采用CAR-NK细胞发展肿瘤过继性疗法不仅可以避免CAR-T细胞疗法所面临的主要挑战，还适用于开发“现货型”的肿瘤免疫细胞疗法，提高治疗的安全性，降低治疗费用。与PB-NK、CB-NK和NK-92细胞相比，iPSC-NK细胞在细胞量、同质性、基因编辑等多方面具有显著优势，因此发展“现货型”iPSC-NK细胞疗法是未来肿瘤过继性细胞疗法的重要发展方向。随着临床前研究和临床试验不断取得突破性进展，预示着应用“现货型”iPSC-NK细胞治疗肿瘤的时代正加速到来。

（ID:yxckbsc2024040201）

扫码关注

【01】加强干细胞临床研究质量控制的策略探讨

【02】关于推进干细胞临床研究的若干思考

【03】医疗机构干细胞临床研究学术委员会建设现状与对策思考

【09】临床生物样本库建设的思考

【10】干细胞资源库安全管理体系建设的思考

征稿链接

《医学参考报干细胞与再生医学专刊》 征稿启事

相关链接