撰文│张守梅 马晓雪
编辑│毕紫娟
审校│汤红明
全文约4000字，预计阅读18分钟
【编者按】本公众号邀请了东方医院干细胞基地GMP实验室的白志慧副主任组稿了干细胞检测的系列文章，将分6期推出并详细为大家介绍。第一期推出了《干细胞检测（一）｜了解干细胞产品质量的秘密：基本生物学属性检测》，第二期推出了《干细胞检测（二）｜干细胞应用的生物学安全性》，第三期推出了《干细胞检测（三）｜干细胞微生物学安全性检测》，第四期推出了《干细胞检测（四）| 探索干细胞生物学有效性》，本期推送干细胞检测系列文章的第五篇：干细胞检测（五）｜干细胞残留检测：控制外源风险进入体内。在制备干细胞的过程中，会加入细胞增殖、传代所必需的成分，如培养过程中的培养基、血清、生长因子、抗生素、病毒载体等，或者在处理过程中的消化酶、冻存液等，这些可能会影响干细胞质量和安全性，需要在生产工艺中加以去除，同时还要在干细胞生产终端对其进行残留检测。
一、残留检测的重要性
安全性考量
有效性保障
残留物质的量过高可能影响干细胞的治疗效果。比如，过多的生长因子残留可能会干扰干细胞在体内的正常分化和增殖过程，导致治疗效果偏离预期。如果在细胞培养过程中使用的某些抑制分化的物质残留，可能会阻碍干细胞发挥其应有的功能，无法有效修复受损组织。
质量控制的要求
二、常见的残留检测项目
酶类残留检测
在干细胞的分离、培养过程中会使用一些酶，如重组蛋白酶、胶原蛋白酶。检测酶类残留可以通过检测其酶活性的方法。例如，对于胰蛋白酶，可以利用其对特定底物的水解作用，通过检测水解产物的生成量来确定酶的残余活性，进而推算残余量。目前用的较多的是基于免疫检测的方法，制备针对酶的特异性抗体，通过ELISA等技术进行检测。对于酶类的检测，使用相关试剂盒时，残留的标准应不低于检测试剂盒的检测限度。
二甲基亚砜（DMSO）残留检测
DMSO是一种常用的细胞冻存保护剂，干细胞冻存细胞DMSO的含量在5%~10%。但是DMSO本身有一定的毒性，高浓度的DMSO会对干细胞产生损害，影响干细胞的活性、功能和增殖能力。而且在干细胞用于临床治疗等应用场景时，若DMSO的量过高，一方面会造成输注疼痛，另一方面可能会引起恶心、呕吐、过敏反应等。目前常用的检测方法有气相色谱法、高效液相色谱法、核磁共振波谱法。
培养基或生长因子残留检测
检测培养基或生长因子残留可采用ELISA法、液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术。LC-MS可以对复杂样品中的因子进行分离和准确鉴定，通过与标准品的对比，确定其含量。另外，也有基于生物活性检测的方法，利用生长因子对特定细胞系的刺激作用，通过检测细胞的增殖、分化等反应来间接评估因子的残留量。
血清残留检测
虽然在干细胞生产制备工艺中大多数使用无血清培养基或血清替代物，但也不排除使用非人源血清的可能。从文献检索来看，Mesoblast公司的异体骨髓MSC产品remestemcel-L使用胎牛血清来培养，而且获得美国FDA的认可。检测血清残留的方法有多种，如ELISA。ELISA利用抗原-抗体特异性结合的原理，通过制备针对血清中特定蛋白的抗体，可灵敏地检测出极微量的血清成分。此外，还有基于蛋白质电泳的方法，通过比较样本与标准血清蛋白电泳图谱的差异，来估算血清残余量。
病毒残留检测
这是诱导多能干细胞（iPSC）制备过程中常见的残留检测项目，例如仙台病毒残留检测。仙台病毒是非整合载体，将外源转录因子（KLF4/SOX2/OCT4/L-MYC）导入体细胞进行细胞重编程，在iPSC转染过程中被广泛应用。但仙台病毒属于外源基因，可能对人体健康造成潜在风险，需要进行残留检测。仙台病毒检测的方法以核酸检测为主，包括PCR法、数字PCR法（即通过将反应体系分散为微小单元，结合荧光信号和泊松分布，实现核酸分子的绝对定量分析）。
分化后功能细胞的iPSC残留检测
iPSC在体内有成瘤的风险，为了监测未分化iPSC的残留情况，选择适宜的方法检测iPSC至关重要。相应检测方法包括流式细胞术、qPCR法、数字PCR法、高效培养试验等。ddPCR（Droplet Digital PCR），又称微滴式数字PCR，是新一代的PCR技术，可通过微流控或微孔板将反应体系分成油包水液滴进行独立扩增，从而实现无需标准曲线的精准核酸定量。在特定应用中，可结合高效培养试验以降低检测中非特异性背景信号，并有望实现对残留未分化iPSC的特异性检测。不同实验室检测iPSC残留的方法灵敏度均有差异，其中ddPCR往往能达到更高的灵敏度，但是具体iPSC残留检测方法应结合自身细胞产品特点开发。
三、残留检测的技术挑战
开发更高灵敏度的检测方法
许多残留物质在干细胞中的含量极低，这对检测技术的灵敏度提出了极高的要求。例如，某些生长因子的残留量可能在皮克甚至飞克级别，需要采用高灵敏度的检测仪器和优化的检测方法才能准确检测。同时，低含量检测容易受到样本基质的干扰，样本中其他成分可能会影响检测信号，导致假阳性或假阴性结果。随着科技的不断进步，新的检测技术不断涌现。例如，数字PCR技术有望应用于干细胞残留检测。数字PCR是一种核酸检测技术，和传统PCR相比，数字PCR灵敏度是其100-1000倍。传统PCR是对核酸进行相对定量，而数字PCR能够对核酸进行绝对定量，结果更准确，对于低丰度的核酸检测也更灵敏，可能为检测带来新的突破，对残余物质进行高灵敏度检测。
制定统一的标准
目前，对于残留检测项目和各项目的检测限度，尚未形成统一的行业或国际标准。在方法验证过程中，检测限（即某一分析方法在给定的可靠程度内可以从样品中检测出的待测物质的最小浓度或最小量）和定量限（即样品中被测物能被定量测定的最低量，其数值一般高于检测限）的确定也常成为讨论和关注的重点。如何得到科学、可靠的定量限和检测限，中国药典、美国药典等文件给出了较多参考方法，但在实际应用中，选择哪种方法则需要结合实际情况进行具体分析。建立统一的标准化检测流程，包括样本采集、处理、检测方法的选择、结果的判定等各个环节，将有助于提高检测结果的可比性和可靠性，促进干细胞产业的规范化发展。
四、总结
干细胞残留检测是保障干细胞治疗安全性和有效性的关键环节。尽管目前在检测过程中面临着技术挑战，但随着新型检测技术的研发、标准化流程的建立，干细胞残留检测将更加准确、高效。这将为干细胞在临床的广泛应用和再生医学的发展提供坚实的质量保障，让更多患者受益于干细胞治疗这一前沿医疗手段。
撰稿作者简介
张守梅
撰稿作者简介
马晓雪
审稿人 徐国东
现任武汉珈创生物技术股份有限公司研发总监，微生物学博士，高级工程师。多年来专注于生物制品质量研究，在细胞质量控制领域积累了丰富的经验。发表SCI论文5篇，授权发明专利17项。主持多项省市科研项目，先后获得湖北省科技进步二等奖、湖北省科技成果推广三等奖、光谷3551创新人才。
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