间充质干细胞治疗脓毒症的研究进展
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时事
2024-09-27 15:00
上海
撰文│潘宇晨
编辑│李佳潞
审校│汤红明
全文4400余字，预计阅读20分钟
脓毒症是宿主对感染反应失调导致的以多器官衰竭为特点的临床综合征，常见病因为细菌感染，是重症监护室的“头号杀手”。尽管早期诊断、抗生素的使用及个性化治疗均在飞速发展，脓毒症的院内死亡率仍高于20%，亟待探寻新的治疗方法。间充质干细胞（mesenchymal stromal cells，MSC）是具备自我更新和多向分化潜能的非造血来源的成体干细胞样细胞，具有治疗脓毒症的潜力。根据临床试验网公布的数据（http://clinicaltrials.gov），近年来，在中国、美国、法国、加拿大等多个国家均已开展MSC治疗脓毒症的临床试验。
一、MSC在不同脓毒症模型中的研究进展及临床研究现状
在细菌感染诱导的脓毒症模型中，MSC可与抗生素产生协同治疗作用。笔者所在课题组也发现，与对照组小鼠相比，MSC治疗组小鼠体内巨噬细胞吞噬能力增强，肺部单核细胞和巨噬细胞能分泌更多的抗炎因子；即使不加抗生素治疗也能有效提高小鼠存活率，缓解小鼠肺损伤。MSC还能够降低脓毒症小鼠肝脏和肠道中炎症因子水平，减轻肝脏损伤，改善肠屏障功能。在无菌脓毒症小鼠模型中，MSC通过减少肠道T细胞浸润抑制炎症、改善肠道屏障完整性、恢复肠道菌群稳态。MSC同样能够降低脂多糖诱导的小鼠肺损伤，下调血清中炎症因子水平，提升小鼠生存率。
加拿大渥太华大学的研究团队招募了21例脓毒症患者进行临床Ⅰ期试验显示，MSC的注射剂量在（1.9～25）×107个时，未出现明显不良反应。阿姆斯特丹大学的研究人员使用脂多糖诱导志愿者产生脓毒症样症状，注射MSC能够调节炎症反应，促进凝血功能，减轻脓毒症样症状。此外，病毒感染也可导致脓毒症样症状，例如重症或危重症新冠感染引起的肺炎患者的临床表现可用“病毒性脓毒症”描述。临床研究显示，MSC能够降低新冠感染引起的肺炎患者血清中炎症因子水平，将患者的生存率提升至91%。患者接受MSC治疗的48h内无明显不良反应，约63%的患者在注射MSC后，呼吸困难症状得到缓解，血氧饱和度有所回升。在患者接受MSC治疗的2年后进行追踪调查显示，MSC能够发挥长效保护作用，无相关不良反应，未增加肿瘤发生风险。
近10年来，许多研究表明MSC对于脓毒症中的炎症、器官衰竭、免疫失调等均有不同程度改善作用，动物实验与临床试验均显示MSC能够大幅提升患者生存率。上述结果共同说明，MSC是极具潜力的脓毒症治疗策略。
体内发生严重组织损伤时，MSC通常可快速“归巢”到受损部位，并在该部位停留更长时间以发挥治疗作用。笔者所在团队对比MSC在健康小鼠和脓毒症小鼠中的动态分布发现，由于模型小鼠肺部损伤更为严重，因此在模型小鼠中，MSC倾向于更多更快地聚集到小鼠肺部，短时间内即可显著缓解模型小鼠肺部损伤，同时MSC在肝脏中呈现“先增后降”的模式，可在较长时间发挥肝脏保护作用。尽管这种“归巢”现象的具体机制尚不十分清楚，但是该现象对于缓解脓毒症中各脏器的损伤非常有利。
1. 调节炎性微环境
脓毒症早期患者主要死于剧烈的“炎症因子风暴”，MSC则倾向于在炎性病灶停留更长时间，并发挥抗炎作用，因而有益于提高脓毒症患者的存活率。
一方面，在炎性微环境中，MSC能够分泌前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、白介素-10（interleukin，IL-10）、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）等多种抗炎细胞因子，或释放富含具备抗炎作用的miRNA外泌体，通过抑制核因子-κB（nuclear factor-κB）、信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）等信号通路的活化，降低上皮细胞或组织细胞中促炎因子TNF-α、IL-1β、诱导性一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，BAX）水平，上调抗炎因子和抗凋亡分子的表达，从而直接发挥抗炎、抗氧化作用。
另一方面，MSC能够调节免疫细胞产生炎症因子的能力，间接发挥抗炎作用。MSC能够通过降低线粒体分裂，缓解巨噬细胞中的氧化应激损伤。MSC分泌的PGE2通过与巨噬细胞表面受体结合，抑制巨噬细胞中炎性小体和NF-κB信号通路的活化，诱导巨噬细胞向抗炎表型极化，促进其分泌抗炎细胞因子IL-10。此外，MSC可激活糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3，GSK-3β）和β-catenin信号通路，其中，GSK-3β信号的激活能够诱导巨噬细胞抗炎表型标志物CD206、精氨酸酶-1（arginase-1，Arg-1）和几丁质酶3样分子3（chitinase 3-like 3，Ym1）的表达；Wnt/β-catenin信号的活化同样可诱导巨噬细胞向抗炎表型极化，MSC产生的微囊泡可向巨噬细胞传递miR-181a，从而激活巨噬细胞中STAT5信号，进一步诱导巨噬细胞向抗炎表型极化。
基于上述调节炎性微环境的作用，输注MSC能够缓解脓毒症患者体内的炎症因子风暴，降低促炎因子水平，改善多数生命体征，减轻急性组织损伤。
2. 参与杀灭病原体
MSC可通过分泌抗菌肽直接发挥抗菌作用，目前已知MSC至少能够分泌4种抗菌肽：人防御素-2、抗菌肽LL-37、铁调素和脂质运载蛋白-2（lipocalin-2）。尽管细菌能够进入MSC内部，但目前一般认为MSC本身并不具备清除细菌的能力。
3. 促进组织修复
MSC可进入受损肺部，改善肺部微环境，保护肺泡上皮细胞，促进新生血管生成，并通过分泌生长因子和多种细胞因子，如角质细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF），促进组织修复。KGF通过增强肺泡上皮细胞的增殖和分化能力，促进肺泡上皮细胞稳态恢复，从而有效缓解急性肺损伤。
4. 发挥免疫调节作用
MSC在与病原体接触后能够产生趋化因子或黏附分子，这些因子的激活可促进免疫细胞向病灶迁移。MSC可通过直接接触或分泌细胞因子、微囊泡的方式，影响免疫细胞功能。
►固有免疫细胞
异体移植的MSC并不能在体内长期存活，大部分MSC在移植后的3天内死亡，这部分死亡的MSC主要被巨噬细胞通过胞葬作用摄入并清除，因此，通常认为巨噬细胞是MSC治疗的主要靶细胞。笔者所在团队研究发现，巨噬细胞的胞葬作用有益于MSC对脓毒症的治疗，通过不同的预处理方式增强巨噬细胞胞葬作用，能够有效增强MSC对脓毒症的治疗效果。在炎性环境中，MSC通过调节巨噬细胞胞葬作用影响巨噬细胞的增殖，缓解其细胞衰老，并由此调节巨噬细胞的多种生物学功能。
除此之外，MSC可通过旁分泌途径下调NK细胞表面活性受体蛋白表达，抑制NK细胞中JAK/STAT和AKT信号通路的活化，调节NK细胞产生IFN-γ和颗粒酶B的能力，从而影响NK细胞的细胞毒性效应。MSC分泌的其他可溶性因子还能够调节中性粒细胞的炎性表型及死亡进程、促进树突状细胞向调节性树突状细胞分化，从而缓解氧化应激，减轻脓毒症中各组织损伤，促进受损组织修复。
通常认为固有免疫中的吞噬细胞，如巨噬细胞和中性粒细胞，是宿主体内清除病原体的主力。MSC通过分泌IL-8和巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）招募中性粒细胞向炎性病灶浸润，血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）增强巨噬细胞的吞噬和杀菌能力。基于上述作用，MSC通过促进吞噬细胞吞噬活性，调节机体内促炎因子和抗炎因子动态平衡，提高脓毒症患者的存活率。
► 适应性免疫细胞
MSC分泌的TGF-β1、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、IL-10、PGE2、吲哚2,3-双加氧酶（indoleamine2,3-dioxygenase，IDO）等因子可将T细胞的细胞周期阻滞于G0/G1期，以抑制T细胞（包括Th1、Th17和细胞毒性T细胞）的活化和增殖。MSC能够诱导T细胞向Treg细胞分化，调节Treg细胞和Th17细胞亚群之间的平衡。在自然衰老脓毒症大鼠模型中，尾静脉注射MSC能够提高CD4+/CD8+T细胞的比值，调节淋巴细胞亚群的平衡。另外，MSC还通过激活MST1-mTORC1-STAT1信号通路抑制B细胞的增殖及向浆细胞分化，降低趋化因子和免疫球蛋白的分泌。
综上所述，在炎性微环境中，MSC能够产生大量免疫抑制分子，降低整体免疫反应水平，防止免疫细胞过度活化引发的“炎症因子风暴”，降低多脏器、组织内的炎性细胞浸润，从而缓解脓毒症患者的组织损伤（图1）。MSC对疾病的治疗效果部分取决于其在体内的归巢能力，适当的预处理能够提高MSC在体内的细胞活力，延长其滞留时间，增强其免疫调节功能。
1. 加热预处理
使用42℃水浴加热细胞1h即可制备热休克的MSC。热休克预处理通过下调p38/MAPK/mTOR信号通路，诱导MSC发生自噬，增强MSC在氧化应激环境下的细胞活力。热休克预处理能够延长MSC在受损部位的停留时间。如果将温度提升至50℃，则制备的是热灭活的MSC，热灭活预处理可增强巨噬细胞对MSC的吞噬，提升脓毒症小鼠的存活率。
2. 药物预处理
雷帕霉素通过激活CXCR-4/CXCL12信号轴，从而增强MSC的迁移能力和抗炎作用。NF-κB信号通路的活化能够促进MSC分泌细胞因子（HGF、VEGF、IGF等），并增强其迁移能力。褪黑素预处理能够增强MSC抗炎效果，笔者所在团队也报道了褪黑素预处理能够通过上调MSC中半乳糖凝集素3的表达，促进巨噬细胞更多地向抗炎表型极化，从而缓解小鼠子宫炎症。3. 低氧预处理
使用1%氧气浓度进行低氧处理可诱导MSC产生富含circOXNAD1的外泌体，发挥更强的抗炎功能，降低神经细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子产生。低氧预处理还可通过上调miR-612促进MSC分泌HIF-1α和VEGF，促进血管生成。使用0.5%～5.0%不同浓度的低氧处理均能提高MSC的功能，但在不同疾病模型中的最佳处理浓度尚不完全清楚。
4. 炎性因子预处理
TNF-α、IL-1β等促炎因子预处理后的MSC常表现出更强大的抗炎功能。笔者所在团队也报道了TNF-α预处理通过上调MSC外泌体中半乳糖凝集素1的表达，从而增强MSC促进巨噬细胞向抗炎表型极化的能力。脂多糖预处理的MSC与巨噬细胞共培时能够显著降低巨噬细胞促炎因子TNF-α、IL-1β、iNOS和IL-6的表达，上调抗炎标志物Arg-1和CD206的表达，增强MSC对脓毒症的治疗效果。
5. 基因编辑技术
通过病毒或非病毒载体可以将已知功能的基因导入MSC，以此特异性编辑MSC的分化、免疫调节、归巢能力或基因特异性功能。例如过表达HGF可增强MSC归巢功能，减少胶原沉积，增强MSC对急性肝损伤小鼠的保护作用。基因编辑导致细胞遗传和表观遗传学改变使MSC的变化可控且更剧烈，但在使用时需要考虑脱靶效应和病毒扩散的潜在影响。
6. 新型纳米材料
纳米材料拥有独特的理化性质和便于修饰的表面，在不同领域中均显示出巨大应用潜力。其中，铁基纳米颗粒毒性小、代谢快，是MSC最常用的示踪剂，可用于活体成像。笔者团队前期研究显示，纳米氧化铁颗粒不仅可以辅助示踪MSC在体内的动态分布，还可以通过影响MSC脂代谢相关基因，增强其对脓毒症的治疗效果。
由于人体的复杂性和细胞因子的多样性，仅干预某一种细胞因子并不足以有效缓解脓毒症中的炎症因子风暴，通常也无法应对脓毒症中的免疫反应失调。MSC因其优秀的双向调节能力，为脓毒症的治疗提供了更多的可能性。MSC不仅能够分泌细胞因子调节免疫系统平衡，还可以分泌生长因子加速组织修复，也能通过直接和间接途径缓解脓毒症中的炎症因子风暴、器官衰竭，预防或减轻多种并发症的出现。
目前，已有大量临床前研究表明，MSC是治疗脓毒症的有效手段，极具发展价值。尽管大部分临床研究也报道了MSC治疗脓毒症是安全有效的，但是这部分研究内容有限，病例数量也有待进一步扩充。此外，在MSC的应用推广过程中，如何大规模制备质量稳定且相对均一的MSC可能也是亟待解决的问题。
现任徐州医科大学讲师，九三学社社员，江苏省免疫学会免疫与代谢专委会委员，中国免疫学会会员。博士毕业于南京大学，现从事固有免疫细胞在感染免疫中的作用及机制相关研究，以第一作者在Cell Death & Disease、Theranostics等杂志发表论文5篇，以共同通信作者身份发表论文2篇，参与发表论文共20余篇。主持各级科研项目3项。
【01】加强干细胞临床研究质量控制的策略探讨
【02】关于推进干细胞临床研究的若干思考
【03】医疗机构干细胞临床研究学术委员会建设现状与对策思考
【09】临床生物样本库建设的思考
【10】干细胞资源库安全管理体系建设的思考
征稿链接
《医学参考报干细胞与再生医学专刊》 征稿启事
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