研究探讨了微泡低强度聚焦超声（LiFUS）对血脑屏障（BBB）的潜在影响，特别关注嘌呤能P2X7受体的作用。实验中，Sprague-Dawley大鼠接受0.3 MPa能量的LiFUS处理，通过蛋白质印迹分析评估P2X7受体及其下游信号传导的变化，并检测BBB紧密连接蛋白ZO-1和occludin。伊文思蓝染料渗透量用于评估BBB渗透性，而TUNEL测定和苏木精-伊红染色验证了处理的安全性。结果显示，LiFUS后P2X7受体及其信号传导显著增加，而紧密连接蛋白表达降低，但随时间恢复正常。使用P2X7拮抗剂可减轻LiFUS对BBB的影响。研究揭示了LiFUS影响BBB的机制，并为调节BBB提供了新见解。
血脑屏障 (BBB) 是一种复杂的结构，在维持中枢神经系统 (CNS) 内的稳态方面发挥着至关重要的作用1。BBB 由紧密连接的内皮细胞、基底层、星形胶质细胞的端脚以及嵌入基底膜的周细胞组成。这种独特的排列赋予大脑免疫特权，同时对脑部疾病的治疗提出了巨大的挑战。为了促进药物有效地穿过血脑屏障，已经进行了许多尝试；然而，优化方法尚未建立。微泡LiFUS技术前景广阔，高强度聚焦超声已用于组织热凝固治疗特发性震颤。这些技术为神经科学领域超声应用奠定了基础。
LiFUS与传统聚焦超声不同，通过微能量使微泡振荡，导致血脑屏障（BBB）非侵入性、短暂性和局部性打开。研究广泛探讨了LiFUS调节BBB的潜力，分析了其稳定性，并针对神经退行性疾病如帕金森病和阿尔茨海默病进行了药物递送研究。同时，研究了超声处理后大脑微环境的变化和LiFUS后的安全性及炎症反应。尽管如此，LiFUS诱导BBB调节的分子机制和主要因素仍不完全清楚。
当大脑受到外部压力时，细胞外ATP水平上升，激活嘌呤能受体，尤其是P2X7受体。P2X7受体是一种ATP门控离子通道，广泛分布于神经血管单元的多种细胞中，与炎症、细胞凋亡等生理病理过程相关。研究显示，P2X7受体在神经退行性疾病和肿瘤中起重要作用，特别是在炎症反应中。调节P2X7受体可防止血脑屏障损伤，并减轻酒精、尼古丁等暴露造成的损害。此外，P2X7受体调节还有助于维持紧密连接蛋白的表达，影响血脑屏障通透性。在成骨细胞模型中，LiFUS后P2X7受体mRNA表达上调，显示其在调节该受体表达中的潜力。研究探究LiFUS对大脑微环境及BBB的影响，特别是P2X7受体的作用。基于先前研究，我们假设LiFUS可能通过P2X7受体调节BBB，并分析了相关因素及其潜在机制。
LiFUS 后 MRI 图像中的信号变化。( a ) 代表性 MR 图像，以确认 BBB 的打开。使用 T2 加权图像（左）和 T1 加权图像（右）。与相反的情况相比，可以看到 BBB（白盒，带有 LiFUS）的开口。比例尺：2.5 毫米。( b ) LiFUS 后 ROI 中的增强信号。所有数据均表示为平均值±SD ( n = 3)。
超声处理后 P 2 × 7受体和下游信号通路的调节。( a ) LiFUS 后大脑海马区DAPI（蓝色）、P 2 × 7受体（白色箭头，绿色）和 RECA-1（白色箭头，红色）的代表性 IHC 图像。比例尺：100 μm。( b , c ) P 2 × 7受体的蛋白质印迹和 RT-PCR 结果。条形图显示了受体相对于对照的标准化水平。还包括每组的带强度图像。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001；与 1 小时相比，#p < 0.05，### p < 0.001；与康相比。( d、e ) NLRP3 炎性体的蛋白质印迹和 RT-PCR 结果。NLRP3的分析方法与P 2 × 7受体的分析方法相同。** p < 0.01，*** p < 0.001；与 1 小时相比，& p < 0.05，&& p < 0.01；与4小时相比。( f , g ) IL-1ß 的蛋白质印迹和 RT-PCR 结果。NLRP3的分析方法与P 2 × 7受体的分析方法相同。* p < 0.05，** p < 0.01，***p < 0.001；与 1 小时相比，# p < 0.05；比较Con。所有数据均表示为平均值±SD ( n = 5)。进行单向方差分析与 Tukey 的多重比较检验。
LiFUS技术因其BBB时间调制优势而备受瞩目，能增强脑部疾病治疗药物的输送。然而，其调节BBB的分子机制尚不明确。研究P2X7受体在LiFUS介导的BBB调节中的作用，发现激活的P2X7受体及其相关因子在超声处理后1小时达到峰值，与紧密连接蛋白减少同步。P2X7受体的存在显著影响染料泄漏程度，为理解其在LiFUS中的调节作用提供了新见解。
图6
研究的图形总结。( a ) 将 0.5 MHz 换能器放置在大鼠的头骨上，并进行超声处理。受 LiFUS 能量影响的血管内的微泡使 BBB 松动，使其具有渗透性。海马区是分析的主要区域。( b )与对照组相比，LiFUS处理组中P 2 × 7的表达上调观察到受体、NLRP3 和 IL-1ß 的表达水平下降，同时紧密连接蛋白和 RNA 的表达水平下降。因此，与对照条件相比，薄壁组织中伊文思蓝染料的泄漏增加。在拮抗剂治疗组中，观察到蛋白质和RNA表达水平的变化，但未达到统计学显着性。伊文思蓝染料泄漏量也不显着。( c ) 虽然 LiFUS 会诱导与炎症反应相关的标记物（包括 NLRP3、IL-1ß 和 NF-κB）暂时上调，但该技术是安全的，因为它不会达到导致超声处理区域细胞损伤或出血的水平。
研究显示，LiFUS对血脑屏障（BBB）有影响，主要关注超声引起的脑血管变化。研究发现LiFUS后内皮细胞形态和超微结构变化，增强了大分子通透性。分析BBB相关蛋白揭示了多种物质通过BBB的可能机制，但精确机制未确定。本研究揭示了LiFUS引起的神经血管单元复杂变化，P2X7受体是关键介质。超声处理后空化现象提供了线索，伊文思蓝染料泄漏差异突出了LiFUS诱导的BBB调节的多方面性质和P2X7受体的参与。尽管拮抗剂治疗未能完全限制通透性，但这些结果可能由于LiFUS诱导的BBB调节涉及多种途径。因此，全面了解BBB调制需考虑各种途径。的研究深入探讨了LiFUS技术的安全问题。监测超声处理后BBB调节和炎症反应对预防潜在水肿或出血至关重要。研究发现，LiFUS后NF-κB通路改变，与炎症相关的细胞因子短暂上调后逐渐正常化。促炎因子在超声处理后4小时短暂增加，24小时内恢复正常。TUNEL和H&E分析确认无脑组织损伤。因此，LiFUS引起的BBB变化是短暂的，未达到严重程度。在相似强度能量的研究中观察到轻微或更小的炎症反应。结果表明，在明确参数下LiFUS可以安全应用。
P2×7受体参与LiFUS诱导的BBB调节。LiFUS能量转移受个体差异影响，尤其在阿尔茨海默氏病等需控炎症的疾病中。LiFUS能量施加约2分钟，BBB约1天恢复正常，4小时后打开以促进药物累积。P2×7受体拮抗剂可调节紧密连接松动程度，不影响超声处理区域。拮抗剂治疗组P2×7受体表达略有增加，24小时内恢复基线。调节P2×7受体活性可能减轻炎症过程，需进一步研究优化治疗参数。本研究可能扩大LiFUS应用范围。
我们的研究揭示了LiFUS在不损伤大脑的情况下调节血脑屏障的潜在机制，但存在局限。首先，P2X7受体激活的具体来源不明，尽管我们推测可能来自内皮细胞。其次，研究主要分析了0.3 MPa能量水平下的脑内反应，但超声能量的使用功率范围应更广泛。最后，研究在正常生理状态下的大鼠上进行，而在疾病状态下的生物反应可能不同。因此，未来研究应包括不同脑部疾病模型以促进全面理解和安全应用。
结论
研究显示，LiFUS后P2X7受体和BBB蛋白表达变化，影响BBB开放程度。这些发现揭示了LiFUS调节BBB的机制，并支持其作为非侵入性调节BBB策略的潜力。
验程序方案。( a )功能和病理评估的实验时间线示意图。( b ) 用于蛋白质印迹、IHC、RT-PCR 和伊文思蓝定量的研究区域示意图。
低强度聚焦超声 (LiFUS) 微泡治疗大鼠
连接波形发生器（33220 A, Agilent）至功率放大器（240 L, LENI Inc.），并用耦合器（Pulsar C30-102–481/2 N）连接放大器、传感器和示波器。使用515 kHz传感器（H-107MR, Sonic Concept Inc.），固定在锥体上，锥体尖端包裹聚氨酯膜，预填充脱气水。示波器（DSOX2002A; Keysight Technologies）监测射频信号。大鼠经氯胺酮混合物麻醉后置于立体定位框架，头皮剃毛并切开止血。使用超声传输凝胶（ProGel; Dayo Medical Co.）填充头骨与锥体尖端间隙，目标区域为右侧海马。微泡注射后10秒开始超声处理，参数为：0.3 MPa，2分钟，10毫秒爆发持续时间，1 Hz脉冲重复频率。动物分为四组：LiFUS和对照组后1、4、24小时。对照组无超声处理。P2X7受体拮抗剂（A430879, HY-15488; MCE）稀释生理盐水中，超声处理前20分钟腹腔注射100 mg/kg。所有组后续程序相同。
磁共振成像 (MRI)
超声处理1小时后，使用Bruker 9.4 T MRI系统（Biospec 94/20 USR）和大鼠头部线圈进行成像。动物在2%异氟烷麻醉下接受静脉注射钆布醇（0.2 mL/kg），并采用对比增强T1加权序列（TE 2 ms，TR 8.06 ms，ETL 2，切片厚度1 mm）评估BBB开放。每组3只大鼠进行统计分析。
