吕建林说结石（47）：黄嘌呤尿症

2. 异或的整体结构

     XOR 是一种 300 kDa 的大蛋白质，由约 1330 个氨基酸和 2 个约 150 kDa 的亚基组成。每个亚基由三个结构域组成：一个包含两个 [2Fe-2S] 簇 (20 kDa) 的 N 端结构域、一个包含 FAD (40 kDa) 的中间结构域和一个包含钼辅因子 (Moco) 的 C 端结构域（ 85 kDa）（图2）。连接每个结构域的接头肽由大约 60 个氨基酸组成。XOR 在组织中以 XDH 形式存在，并使用 NAD+ 作为电子受体，但哺乳动物酶将其转化为 XO 并使用 O ₂作为电子受体。

催化羟基化反应的关键位点是C端85 kDa结构域中的MOCO。MOCO含有一个钼原子，与两个硫原子结合。钼在氧化态多样，氧化型XOR中为MO（VI），酶还原时转变为MO（IV）。氧化态下，钼通过硫化物、氧和羟基进一步配位；还原态下，Mo = S被Mo sh取代。图3显示了MOCO和底物结合位点周围氨基酸残基的空间排列，这些残基（ARG881、GLU803、GLU1262）在不同物种中高度保守，参与反应机制。

      N末端20 kDa域含Fe/Si和Fe/S II两种[2FE-2S]聚类中心，分别与α-螺旋结构域的CYS-XAA2-CYS和N-Terminal-CYS-X-CYS-X-CYS序列结合。Fe/Si和Fe/S II在氧化还原电位和EPR信号上不同，后者电位更高。电子通过Fe/Si和Fe/S II传递至钼，孢子蛋白环参与电子转移。FE/SII与FAD靠近，Fe/Sii在酶更新中调节FAD反应性。中央40 kDa域含FAD和NAD结合位点，FAD位于深裂口中，NAD可访问FAD。Phe337与人序列中异咯嗪环平行，附近有Arg335、Trp336、Arg427、Phe550组成的簇，主要通过π-阳离子相互作用结合。Asp429比Arg426更接近黄素。这些区域参与XDH到XO的转化。

3. 尿酸生成的反应机理

       黄嘌呤羟基化机制需知XOR抑制剂与酶复合物晶体结构。黄嘌呤与氨基酸残基形成氢键，C8朝向钼。C2的C=O与Arg881作用，Glu803质子化，与N7的NH和C6的C=O形成氢键。Glu1262从Mo-OH获质子，与黄嘌呤N9形成氢键。N7和N9间氢键促进Mo-O-对黄嘌呤C8位亲核攻击，H−移至Mo=S变为Mo-SH。两电子转移至钼，Mo(VI)还原为Mo(IV)。形成反应中间体Mo(IV)-OC后被尿酸取代，Mo(IV)重新氧化为Mo(VI)，电子经Moco、Fe/SI、Fe/SII和FAD快速转移，最终还原NAD+或O2产生NADH、O2-或H2O2。

4. 抑制剂的抑制机制

别嘌醇具有一种结构，其中低黄嘌呤的C8和N7互换（图4 A）。因为它具有嘌呤骨架，因此由XOR和醛氧化酶（AO，EC：1.2.3.1）羟基羟基羟基化，并被其他嘌呤代谢酶（例如HPRT和Purine核苷磷酸化酶（PNP，EC：2.4：2.4）代谢.2.1）[ 32 ]。别嘌呤醇作为酶的自杀底物，XOR抑制的机理如下所述。别嘌醇的C2是羟基化并转化为黄墨醇的。在反应过程中，瞬时生成的Oxypurinol的Mo（IV）和N8形成共价键（图4 A）[ 33，34]。在此过程中，奥昔嘌呤醇被认为通过在底物结合袋中旋转而有效地形成复合物。与黄嘌呤一样，氧嘌呤醇与 Glu803、Arg881 和 Glu1262（人）形成氢键（图 4 A）。

非布索坦分子大于别嘌呤醇，无嘌呤骨架，临床优势在于不影响其他嘌呤代谢酶。其结构含噻唑环和苯环，适应酶结构。非布索坦与酶形成离子键、氢键、π-π相互作用及范德华相互作用，但不与钼共价结合。Febosostat中的CN组与ASN769形成氢键，远离活性中心。其抑制作用强，动力学模式为混合抑制。Topiroxostat为自杀底物抑制剂，其C原子与钼形成共价键，稳定结构，不易裂解。其CN组、氮原子与酶残基形成键合，三唑环与Phe915和Phe1010有π-π相互作用，是混合抑制剂，结合别嘌呤醇和非布索坦特性。

5. XOR 抑制剂的潜在影响

阿罗嘌呤醇和Febosostat的心血管安全性是国际关注的焦点。2018年CARES研究显示，Febosostat相较于别嘌呤醇有更高的全因死亡率和心血管死亡风险，引发FDA警告。但后续研究对此提出质疑，2020年快速审判研究认为非布索坦与别嘌呤醇心血管安全性相当。有观点认为XOR抑制剂可能减少心血管损伤和死亡。CARES试验中多数死亡发生在停药后。XOR抑制剂改善心血管疾病的报道基于其与氧化应激的关联。XDH在特定条件下转化为XO产生ROS，具有多种生理病理作用，包括防止感染和缺血再灌注损伤。XOR的XDH形式具有NADH氧化酶活性，产生ROS，可能参与组织损伤。在心血管系统中，XOR参与NO产生，是有效的血管扩张剂。低氧条件下XO降低2具有组织保护作用。未清除的ROS会产生过氧亚硝酸盐（Onoo-），导致内皮功能障碍。因此，在氧化应激期间使用XOR抑制剂可能具有保护作用。但过低的血清尿酸水平与不良生物学效应相关，尿酸作为抗氧化剂和自由基清除剂对氧化应激损伤有保护作用。目前无证据表明现有XOR抑制剂会造成氧化应激损害。对XOR缺陷患者的分析有助于阐明这些机制。

6. XDH 到 XO 的转换

    XDH到XO的可逆转化涉及Cys536间形成二硫键，不可逆转换包括蛋白水解和Helix531-535的损失。这导致溶剂门开启，A环移动阻止NAD+接近，FAD周围静电环境变化增加其与氧气反应性。C末端肽参与转化，影响NAD结合和构象稳定。XO ki小鼠肿瘤生长更强，可能促进软骨细胞矿化和骨关节炎病理性钙化。

7. 异或的缺陷

      XOR缺陷分为三型：I型（OMIM #278300）是孤立XOR缺陷；II型（OMIM #603592）由MOCOS缺乏引起，导致XOR和AO双酶缺乏；III型（OMIM #603707）由钼蝶呤生物合成途径酶缺乏引起，导致XOR、AO和SO三酶缺乏。MOCOS通过向Moco添加硫原子激活XOR，而SO活性在II型中不受影响。XOR和AO的硫配体需在成熟步骤中添加。

I型和II型黄嘌呤尿症表型相似，难以临床区分，发病率约1/69,000。III型表型不同，易区分。III型缺陷导致硫酸盐氧化异常，亚硫酸盐在体内积累，表现为尿液中亚硫酸盐增多、大脑硫酸盐积聚，引发神经系统症状、发育延迟和晶状体脱位。

8. 检测到的基因异常

XOR存在多种突变和SNP，主要在Moco结构域。表1和图7显示了氨基酸突变位点。人类XOR为1333个氨基酸，但无义突变产生截短蛋白。Arg228Ter突变患者XDH mRNA正常，无酶蛋白。错义突变导致完全折叠蛋白，但催化残基突变可能致活性丧失，即使非直接相关也可能影响构象而部分失活。

      Fe/S结构域的错义突变影响Fe/S簇形成，可能导致电子转移异常。Arg149Cys突变（图7A）关联1型黄嘌呤尿症]。Cys残基突变导致活性丧失、单体不稳定及Moco缺乏，对蛋白质折叠、二聚体形成和Moco插入至关重要。Gln102Arg突变改变静电环境，可能破坏Fe/S簇结构，导致错误折叠。XOR参与硫嘌呤药物代谢，如6-MP，突变和抑制剂可能增加血药浓度和毒性。四个基因突变（Thr117Ser，Gly172Arg，Ile703Val，ARG913GLN）与硫嘌呤不耐受相关。Kudo等比较了XO突变体对黄嘌呤和6-TX的氧化活性，发现Arg149 Cys突变体对两者均无活性。Thr117Ser和Arg913Gln突变体可能影响活性降低，而Ile703Val突变体在黄嘌呤底物时Vmax高2倍，但在6-TX时低69.4%。His1221Arg和Ile703Val突变与活性增加相关，可能影响尿酸释放速率。哺乳动物和细菌XOR晶体结构相似，但抑制剂非布索坦的结合强度有差异。MD模拟显示细菌酶无法维持与抑制剂的结合。Gly172arg位于Fe/S结构域与FAD结构域连接处，与高血压相关。

     XOR涉及硫嘌呤药代谢，突变或抑制剂可增毒性。特定基因突变关联硫嘌呤不耐受。Kudo研究显示某些XO突变体影响黄嘌呤和6-TX氧化活性。特定突变可能降低活性或增尿酸释放速率。哺乳动物与细菌XOR结构相似，但抑制剂结合有差异。Gly172arg位点与高血压相关。进一步简化：XOR影响硫嘌呤药代谢，某些基因突变增毒性。Kudo发现特定XO突变体改变氧化活性。哺乳动物与细菌XOR结构相似但抑制剂作用不同。Gly172arg位点关联高血压。