第一作者：AndrewP.Stewart
通讯作者：AndrewP.Stewart，MennaR.Clatworthy
通讯单位：剑桥大学
研究速览：
近期，剑桥大学AndrewP.Stewart，MennaR.Clatworthy教授团队在Sci.Transl.Med上发表了中性粒细胞胞外陷阱可保护肾脏免受上行感染，并且是白细胞试纸测试阳性所必需的文章。下尿路感染（UTI）很常见，但很少并发肾盂肾炎。然而，阻止扩展到肾脏的机制尚不清楚。在这里，作者在健康人尿液中发现了中性粒细胞胞外陷阱（NET），它在尿道内提供了抗菌防御策略。在尿路感染的体内小鼠模型（将尿路致病性大肠杆菌接种到膀胱中）和离体人类尿液模型中，NET与尿调节素相互作用，形成捕获细菌的大网。抑制小鼠体内的肽基精氨酸脱亚胺酶4（PADI4）可阻断NETosis并导致膀胱炎进展为肾盂肾炎，这表明尿中性粒细胞的NETosis可以防止细菌上行至肾脏。对英国生物银行数据的分析显示，在多项全基因组关联研究中，与类风湿性关节炎风险增加相关的PADI4基因变异始终与尿路感染易感性降低相关。最后，作者表明，在完整血液中性粒细胞存在的情况下，尿液试纸检测白细胞酯酶呈阴性，但当中性粒细胞受到NET刺激时，结果呈阳性，并且可以通过选择性PADI4抑制来防止这种情况，表明该测试不能检测绝对中性粒细胞计数，正如长期以来所假设的那样，但专门检测已经历NETosis的中性粒细胞。这些发现强调了NETosis在预防泌尿道上行感染中的作用，并提高了大家对医学中最常见的临床测试之一的理解。
要点分析
要点一，研究内容：作者使用尿细胞外囊泡（EVs）的无偏蛋白质组分析，通过共聚焦成像验证，我们在健康人类尿液中的NETosing中性粒细胞和NETs。这些NETs与UMOD相互作用，形成大的网，诱捕致病菌。上、下UTI的小鼠模型在体内验证了这些发现。UMOD和NETs具有明显的协同抗菌功能，主要是介导聚集和细胞毒性。当使用PAID4抑制剂GSK484预防NETosis时，由大肠杆菌引起的膀胱炎恶化为肾盂肾炎和全身菌血症，提示NETosis是防止细菌上升到肾脏的重要机制。作者确定PADI4基因变异与类风湿关节炎（RA）的全基因组关联研究（GWAS），和英国生物样本库和基因型组织表达（GTEx）数据显示，这些变异也导致降低易感性感染，因为改变PADI4表达。此外发现，广泛使用的LE试纸测试专门检测发生了NETosis的中性粒细胞，而不是检测中性粒细胞的总数，重新定义了最常用的护理点诊断测试之一。
图文导读
图1.（A）采用差异超离心和质谱测定健康个体尿液ev和蛋白质组。iBAQ蛋白强度归一化为EV标记CDCD81、TSG101、alialix和CDCD9。每个蛋白质的cv按等级顺序绘制。（B）EV、中性粒细胞或组蛋白对整个蛋白质组的R2值。（C）每个蛋白质的R2对所有其他蛋白质的AUMAP。（D）在UMAP上显示了EV蛋白、中性粒细胞蛋白和组蛋白的富集评分。（E）分离人血液和尿液中性粒细胞，使用抗中性粒细胞颗粒蛋白MPO的抗体（绿色）和DNA的Hoechst染色（蓝色）（左）进行共聚焦显微镜成像。（F）CitH3尿和血中性粒细胞染色（红色），Hoechst（蓝色）Hoechst染色（左），总DNA与Hoechst的比例（右）。（G）用Hoechst染色的DNA（蓝色）和MPO（绿色）。（H）PMA刺激的尿液中性粒细胞或Hoechst染色的DNA（蓝色）和MPO（绿色）。
图2.（A）用Hoechst染色的DNA（蓝色）和UMOD（红色）尿液NET。（B）使用UPEC-mCherry（红色）、Hoechst（蓝色）和游离DNA染料SYTOXgreen（绿色）孵育的尿液的实时成像。（C）通过共聚焦显微镜对患有下尿路感染的单导管膀胱炎小鼠的膀胱（在BioRender中生成的图表）进行成像。使用MPO、CD11b（红色）和HoechstDNA（蓝色）对样品进行中性粒细胞染色。带有NETosisMPO（绿色）、CitH3（粉红色）和HoechstDNA染色剂（蓝色）的放大区域的图。（D）中性粒细胞聚集在膀胱炎膀胱另一段的管腔内，膀胱炎膀胱中用CD11b（红色）、UPEC（绿色）和UMOD（粉红色）染色。（E）通过共聚焦显微镜对患有上尿路感染的双导管肾盂肾炎小鼠的肾脏（图表在BioRender中生成）进行成像。中性粒细胞用CD11b（红色）和UMOD（绿色）和DNA用Hoechst（蓝色）染色。比例尺，1000μm。插图显示了一个放大区域，其中有NETosisMPO（绿色）、CitH3（粉红色）和DNA与Hoechst（蓝色）的染色。 （F）肾盂肾炎肾另一段肾盂内的中性粒细胞聚集，CD11b（红色）、UMOD（绿色）和CitH3（粉红色）染色。
图3.（A）在Bio Render中生成的GSK484抑制NET的情况下膀胱炎、肾盂肾炎和膀胱炎的小鼠模型示意图。（B）膀胱炎和膀胱炎小鼠膀胱和肾脏中的UPECCFU+GSK484小鼠。（C）通过膀胱炎和膀胱炎+GSK484小鼠肾脏流式细胞术定量中中性粒细胞占总免疫细胞的百分比。（D）中性粒细胞（MPO染为绿色）和结构标志物鬼笔环肽（白色）的显微镜检查。 （E）与阳性对照肾盂肾炎小鼠相比，在PADI4抑制小鼠的肾盂中用CD11b（红色）染色的中性粒细胞聚集体通过CitH3（粉红色）染色和Hoechst（蓝色）对DNA和UMOD（绿色）进行NETosis成像。 （F）与单独的阴性对照膀胱炎相比，通过共聚焦显微镜评估膀胱炎+GSK484的肾盂CD11b信号的定量。（G）与肾盂肾炎作为阳性对照相比，膀胱炎+GSK484小鼠肾盂中性粒细胞浸润内UMOD强度的定量。（H）用UPEC-GFP±NETs±UMOD接种培养基，8小时后测量CFU。（I）定量（H）通过SYTOX橙阳性活死染色检测到的（H）死亡UPEC-GFP的百分比。（J）用DNA染料Hoechst（蓝色）观察UPEC孵育的UMOD（绿色）的共聚焦成像。 （K）（I）使用UPEC-GFP（绿色）和活死SYTOX（红色）染色的代表性共聚焦成像。
图4.（A）PADI4中三个主要RAGWASSNP的英国生物样本库数据中UTI的比值比与RA比值，高于1表示积极影响方向，低于1表示消极影响方向。（B）UTI风险等位基因纯合子PADI4中这些SNP的GTExeQTL和sQTL表达数据与风险RA等位基因的杂合子和纯合子的比较。（C） SNP在传染病蜂窝织炎（蓝色）、肺炎（橙色）和骨髓炎（红色）中的英国生物样本库比值比，与另一种自身免疫性疾病：硬皮病（黑色）形成对比。（D）根据试纸上的白细胞酯酶（LE）+/-对尿液EV蛋白质组进行划分，火山图显示红色蛋白质丰度发生显著（P<0.05）变化。（E）图1中的中性粒细胞、组蛋白和EV蛋白在LE+/-样品中绘制为归一化iBAQ丰度。（F）对分离的人血中性粒细胞进行LE检测;中性粒细胞与PMA、PMA+GSK484或对照一起孵育;LE测试;并在（G）中量化。（H）将（G）中的样品与游离DNA染料SYTOX绿色一起孵育以检测NET（绿色），并进行MPO染色（红色）以显示所有中性粒细胞。（I）将NETs与DNase或对照一起孵育，然后离心，评估上清液的LE活性并定量。（J）通过共聚焦显微镜对UTI和LE+试纸棒患者的尿液样本进行成像，并进行MPO（红色）、UMOD（绿色）和Hoechst（蓝色）染色。
结论
综上所述，作者对尿液中EV的蛋白质组学分析揭示了健康个体尿液中存在的未被重视的蛋白质亚群，包括一组NET蛋白。因为作者的分析策略允许鉴定独立变化的蛋白质亚群，所以这种方法不仅有助于改进尿液EV蛋白质组的表征，而且可以应用于其他复杂的生物样品。作者在健康个体的尿液中发现 NETs 表明了一种可以迅速触发以防止上行性感染的策略。
全文链接：https://doi.org/10.1007/s42765-024-00476-8
参考文献：AndrewP.Stewart,KevinW.Loudon,MatthewRoutledge,ColinY.C.Lee,PatrickTrotter,NathanRichoz,EleanorGillman,RobinAntrobus,JamesMccaffrey,DavidPosner,AndrewConwayMorris,FionaE.KaretFrankl,MennaR.Clatworthy,Neutrophilextracellulartrapsprotectthekidneyfromascendinginfectionandarerequiredforapositiveleukocytedipsticktest, Sci.Transl.Med
DOI:10.1007/s42765-024-00476-8
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