细菌的基因组就像一个化学宝藏库，藏着各种天然产物基因簇（Biosynthetic Gene Clusters, BGCs），它们是制造抗生素等有用化合物的“工厂”。
但这些宝藏往往深藏不露，要找到它们并激活，需要很大的努力。近日，德国萨尔布吕肯的亥姆霍兹感染研究中心（Helmholtz Centre for Infection Research, HZI）FU Chengzhang教授团队，在其发表在《Science》上的一项研究中，提出了一种名为ACTIMOT（Advanced Cas9-mediaTed In vivo MObilization and mulTiplication）的全新方法。这项工作由XIE Feng和ZHAO Haowen等人共同完成，为天然产物发现注入了前所未有的动力。
新技术ACTIMOT（基于Cas9的高级基因簇释放与放大技术），帮助科学家更快更简单地找到并利用这些宝藏。
从细菌基因“传染”中找灵感
抗生素滥用让细菌抗药性成为了全球健康的威胁，而抗药性基因能够快速传播，靠的是它们依附在“质粒”上。质粒是一种独立于细菌染色体的小型DNA片段，能自己复制并在细菌之间传播。受到这个自然机制的启发，付教授团队设计了一种CRISPR-Cas9工具，把细菌染色体中的大块DNA“搬家”到质粒上，这不仅让它们变得“独立可移动”，还可以在细胞中多次复制，大大提升这些基因簇的功能活性。
ACTIMOT是如何工作的？
ACTIMOT系统由两部分组成：一种工具负责“释放”基因簇，另一种工具负责“搬家”并复制它们。研究人员用这个系统对一种名为“放线红素”（actinorhodin）的24-kb基因簇进行了测试。这些基因来自模式放线菌（Streptomyces coelicolor M145）。通过ACTIMOT技术，基因簇被成功转移到质粒上，结果产物的产量显著提高。这个实验证明了ACTIMOT的可行性。
挖掘新的天然产物
研究团队进一步用ACTIMOT探索了多个复杂的基因簇，并找到了以下几个全新天然产物：
Avidistatins和Avidilipopeptides：这些肽类化合物来自S. avidinii的一段48-kb基因簇Sav11，之前从未被发现过。
Mobilipeptins：通过激活S. armeniacus的67-kb基因簇Sar13，这类化合物的产量提高了40倍，还揭示了它们的环状肽前体的生产路径。
Actimotins：这类新型化合物来源于S. avidinii的149-kb基因簇Sav17，包含苯并噁唑结构。其中一种化合物在稳定甲状腺素转运蛋白方面表现出了与现有药物相当的活性。
这些发现表明，细菌基因组中隐藏了大量化学资源，通过ACTIMOT可以将这些“沉睡”的宝藏挖掘出来。
ACTIMOT工具的构建与操作详解
ACTIMOT的核心设计是通过CRISPR-Cas9技术实现细菌染色体上大段目标DNA区域（Target DNA Region, TDR）的“释放”和“搬迁”，使其在同一细胞内跳跃到质粒上并实现高效复制。以下是这一系统的具体操作步骤：
1. 工具质粒的设计
ACTIMOT系统由两种工具质粒组成：
pRel质粒（释放质粒）：负责TDR的释放，包含以下关键组件：
优化后的Cas9基因，确保在细菌中高效表达。
单链向导RNA（sgRNA）盒，用于靶向TDR两端进行精准切割。
Streptomyces专用复制子（来自pSG5质粒），确保质粒在放线菌中的稳定存在。
pCap质粒（捕获质粒）：负责TDR的搬迁与复制，包含：
细菌人工染色体（BAC）骨架，适用于携带大段DNA。
Streptomyces特异复制子（来自pSG5或pIJ101），确保与pRel兼容。
两段同源臂（Homologous Arms, HAs），用于与TDR两端序列进行同源重组，完成TDR的搬迁。
2. 系统的具体操作
释放目标DNA：
pRel质粒被导入细菌宿主后，Cas9通过两个sgRNA分别靶向TDR两端，在染色体上切割形成双链断裂（Double-Strand Breaks, DSBs）。
DSB通过pRel上的同源臂（DelL和DelR）引导进行同源修复，确保释放区域周边序列的完整性。
捕获与重组：
pCap质粒被切割后暴露出同源臂（CapL和CapR），形成线性化质粒，这为TDR的插入提供了“落脚点”。
释放的TDR通过同源重组整合到pCap质粒中，形成一个多拷贝存在的重组质粒。质粒中的BGC在pCap复制子的作用下进行高效复制。
验证搬迁与功能激活：
携带pRel和pCap的细菌通过两步接合（conjugation）将质粒导入目标宿主。在TDR成功搬迁到pCap后，通过PCR验证重组质粒是否正确整合了目标序列。
重组质粒随后被电转化至E. coli进行进一步验证，包括限制性酶切分析和功能测试，以确保目标BGC完整、功能正常。
3. 实验验证：放线红素BGC的激活
研究团队选择模式放线菌Streptomyces coelicolor M145中的24-kb放线红素（Act）BGC进行验证：
构建了pRel-ACT-dsp和pCap-101-Hyg-ACT-LR质粒，通过两步接合导入M145宿主。
在PCR验证后，成功获得携带pCap-Act质粒的菌株。这些菌株表现出更深的色素，表明放线红素的产量显著提升。
随后将验证后的质粒电转入E. coli，并通过限制性酶切进一步确认重组质粒的正确性。
为什么ACTIMOT这么厉害？
传统的分子克隆方法难以处理大块的基因组DNA，而ACTIMOT能轻松完成这个任务。更重要的是，这项技术可以不改变原有基因簇，就通过基因拷贝数的增加直接提高产量。而对于那些在细菌中被抑制的基因簇，还可以把它们搬到易操作的宿主中进行生产。这种灵活性为科学家们提供了更高效、更可靠的工具。
新工具带来新希望
通过ACTIMOT，付承章团队成功挖掘出了四种此前未被发现的天然产物，为未来开发新型抗生素和药物提供了无限可能。随着这一技术的优化和推广，科学家有望解锁更多细菌基因组中的秘密。这项工作不仅是基因编辑技术的一次创新应用，也是天然产物研究领域的重要突破。
（原文标题：Autologous DNA mobilization and multiplication expedite natural products discovery from bacteria）
