在基因编辑领域，CRISPR-Cas9技术无疑是革命性的。然而，随着研究的深入，人们也发现了一些局限性。例如，在基因组中引入外源片段的“敲入”（knock-in, KI）效率始终难以令人满意，尤其是在临床相关的原代细胞中，这限制了基因编辑技术的广泛应用。近期，美国Nationwide Children’s Hospital的Karen L. Kanke博士团队在《核酸研究》（Nucleic Acids Research, NAR）发表了一项突破性研究，题为“Single-stranded DNA with internal base modifications mediates highly efficient knock-in in primary cells using CRISPR-Cas9”，为提高敲入效率提供了新的解决方案。本文将带您深入解读这项研究及其潜在的重大意义。
背景回顾：敲入效率瓶颈与现有策略的局限
CRISPR-Cas9通过单向导RNA（sgRNA）引导酶切特定位点，诱导双链断裂（DSB），随后细胞通过内源的DNA修复机制完成断裂的修复。这些修复机制包括非同源末端连接（NHEJ）、微同源末端连接（MMEJ）和同源重组（HR）。其中，HR能够精准地插入外源片段，但需要配合同源模板DNA才能实现。然而，目前主流的模板交付方式，如腺相关病毒（AAV）载体，虽然可以较高效地实现敲入，却存在操作复杂、生产周期长，以及引发不良免疫反应等问题。
相比之下，短单链DNA（ssDNA）因其操作简单、非病毒性质，被认为是一种理想的替代方案。但其效率远低于AAV，尤其是在原代细胞（如造血干细胞和气道基底干细胞）中。这一低效问题主要源于ssDNA在细胞内易被核酸酶降解。尽管末端修饰技术有所改善，但仍不足以在多种细胞类型中显著提高敲入效率。
研究亮点：化学修饰激活“增强单链DNA”（esDNA）
为了解决这一问题，Kanke团队尝试了一种创新方法：在ssDNA的内部碱基随机引入化学修饰，以提高其抗降解能力。这种经过修饰的ssDNA被称为“增强单链DNA”（enhanced ssDNA, esDNA）。
他们的研究表明，在12%至19%的内部碱基位置加入化学修饰（如磷硫酯修饰和2’-O-甲基修饰），能够显著提高敲入效率：
在气道基底干细胞（ABCs）中，使用esDNA的CFTR基因敲入效率提高了2至3倍，达到超过50%。
在造血干细胞（CD34+）中，结合DNA-PKcs抑制剂时，HBB基因的敲入效率甚至达到了70%。
相较于传统的末端修饰ssDNA和AAV模板，esDNA在多种临床相关细胞中的敲入效率可与后者媲美。
这一成果尤其引人注目，因为它不仅显著提升了效率，还减少了复杂设计的需求。
深度解读：化学修饰背后的机理与适用范围
抗降解机制 研究发现，esDNA能够有效抵御细胞内的3’修复外切酶1（TREX1）降解，而TREX1正是ssDNA在许多细胞中失活的主要原因。通过敲除TREX1基因，研究团队还证明了在其缺失的细胞环境中，未修饰的ssDNA也能达到与esDNA相似的敲入效率。
细胞类型差异
虽然esDNA在ABCs、CD34+细胞和内皮细胞中表现突出，但在诱导多能干细胞（iPSCs）中却无明显提升。这可能与iPSCs中天然缺乏TREX1有关。未来挑战与展望
esDNA目前适用于200 bp以下的基因片段敲入，而基因长度插入仍需开发新型的长ssDNA化学修饰方法。此外，这一技术的潜在应用包括：
开发更安全高效的基因治疗方案，用于治疗如囊性纤维化（CF）、镰状细胞贫血（SCD）等遗传疾病。
构建更高效的细胞模型，用于研究癌症、HIV等疾病的发病机制。
总结与意义：非病毒基因编辑的新篇章
Kanke团队的研究表明，内部碱基修饰的esDNA模板为CRISPR-Cas9基因编辑提供了一种非病毒、高效、通用的解决方案。这不仅为基因敲入效率的提升提供了新的视角，也为基因治疗和疾病模型构建带来了更多可能性。在未来，这一技术有望进一步推动基因编辑从实验室走向临床，为精准医学的实现提供坚实基础。
