Journal of Agricultural and Food Chemistry│血红蛋白水解物通过铁结合肽促进小肠铁吸收

研究成果

图1 血红蛋白水解物对小鼠铁水平和十二指肠健康的影响

（A）血清铁水平；（B）十二指肠铁循环相关基因表达；（C）十二指肠HE染色

HHb组的SI浓度明显高于对照组（图1A，P <0.05），但对照组与HHb组的TIBC浓度无明显差异（图1A，P > 0.05）。与此同时，HHb组十二指肠中有关铁储存和铁运输的铁蛋白、PCBP1和HP的mRNA水平明显高于对照组。这些结果表明，血红蛋白水解产物可以促进更多的铁离子从食糜进入血液，从而提高体内铁的水平。此外，十二指肠HE切片显示，HHb组与对照组之间没有显着差异（图1C），表明血红蛋白水解产物以安全的方式促进十二指肠铁吸收。

图2 血红蛋白水解物对INT407细胞活性和铁水平的影响

（A-C）铁离子，血红蛋白水解物消化产物和酪蛋白消化产物对细胞活性的影响；（D）INT407细胞铁吸收量

铁离子对 INT407 细胞的活性影响与浓度有关。在低浓度（0.0001-0.1 mg/mL）下，铁离子增强了INT407细胞的活性（图2A，P < 0.05）。然而，在高浓度（1 mg/mL）下，铁离子显著降低了INT407细胞的活性（P < 0.05），仅为空白对照组的64.81%。HHbxh和Caseinxh增强了INT407细胞的活性（图2B-C， P < 0.05）。该研究为了确保INT407细胞处于正常代谢状态下，选取0.1 mg/mL铁离子和0.5 mg/mL消化产物研究其对INT407细胞铁摄取的影响。刺激24小时后，HHbxh-Fe显著增加了INT407细胞的铁摄取，高于Caseinxh-Fe（图2D，P < 0.05）。这种现象表明，血红蛋白水解产物可能比酪蛋白具有更强的促进铁吸收功能。

图3 血红蛋白水解物结合铁后的结构变化

血红蛋白水解产物的结构在铁结合后发生了变化。粒径是确定物质大小的有效指标。与铁结合后，HHb的粒径从449.00 nm增加到1185.15 nm（图3A，P < 0.05），表明结合铁后血红蛋白水解产物的颗粒变大。粒子的表面电荷可以被zeta电位反射。结合铁后，HHb的zeta电位从-14.08 mV显着增加到-2.68 mV（图3B，P < 0.05）。这表明血红蛋白水解产物的负电荷降低。

傅里叶变换红外光谱法是测量物质结构变化的有效方法。HHb-Fe复合物表现出与HHb不同的FTIR光谱（图3C）。HHb在1633.57 cm-1处的特征吸收峰代表了C=O的拉伸振动，对应于酰胺I带（1700 – 1600 cm-1），与HHb相比，HHb-Fe的吸收峰从1633.57 cm-1蓝移至1662.77 cm-1。C=O的振动强度与分子内氢键力呈负相关，因此C=O振动强度在HHb-Fe中的增加可能表明分子内氢键力减弱，这对铁的结合是有帮助的。HHb在1400 cm-1拉伸振动处的特征吸收峰为-COO-基团。铁结合后，-COO-基团的吸收峰从1400.95 cm-1蓝移至1434.18 cm-1，表明血红蛋白水解产物中的-COO-基团（来源于C-末端和谷氨酸残基）参与了铁结合。该结果与zeta电位的发现一致。HHb在1096.84 cm-1和620.53 cm-1处的特征吸收峰分别代表-C-O-和咪唑的拉伸振动，在铁结合后分别向1112.95 cm-1和611.47 cm-1移动。因此，血红蛋白水解产物上的羧基和咪唑可能是铁结合的关键位点。

紫外-可见吸收光谱是通过分析电子跃迁来确定分子结构变化的有效方法。在这项研究中，与铁结合后，HHb在212nm处的最大吸收峰向214 nm移动，吸收强度显著增加（图3D，P < 0.05）。水解产物中肽在200-400 nm处的最大吸收峰与芳香族氨基酸残基中-C=O-的π→π*转变有关。因此，与铁结合后，HHb在272 nm处的吸收强度上调可能是由于芳香族氨基酸残基参与铁结合，该结果得到同步荧光光谱法的进一步确认（图3）。

表2 血红蛋白水解物中肽丰度和消化稳定

蛋白质水解产物在体内的生物活性取决于其消化肽的氨基酸序列，因此鉴定蛋白质水解产物中肽的氨基酸序列有助于明确其生物活性。血红蛋白水解产物中的肽在胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用下会进一步分裂成更小的肽或氨基酸。血红蛋白β亚基水解产物中只有VDEVGGEA、VDEVGGE、DEVGGEA、NVDEVGGEA、NVDEVGGE、VVYPWTQR、ADAVMGNPK、VNVDEVGGEA、VVYPWTQ、VNVDEVGGE肽不会被切割，VDEVGGEA和VDEVGGE肽的丰度分别占血红蛋白β亚基水解物的68.74%和19.37%，分别相当于血红蛋白水解产物中所有鉴定肽的62.64%和17.65%（表2）。含有VDEVGGEA序列的肽，如VDEVGGEAL和VDEVGGEALGR，也会在消化酶的作用下释放VDEVGGEA肽。对源自血红蛋白β亚基的肽序列的进一步研究显示，DEVGGE序列存在于绝大多数肽中（94.68%的肽源自β亚基，86.28%的水解产物），并且该序列在消化过程中没有被裂解（表2和S1）。鉴于肽的丰度和消化性，VDEVGGEA、VDEVGGE和DEVGGE肽段可能是血红蛋白水解产物铁强化的关键物质基础。

图4 特定肽的铁结合特性模拟和体外测定

（A）非血红素铁结合能力；（B）分子模拟对接；（C）等温滴定量热

VDEVGGEA、VDEVGGE和DEVGGE等3种肽均具有较好的铁结合活性，其中VDEVGGE肽的铁结合活性最强，VDEVGGEA肽的活性最低（图4A，P < 0.05）。分子对接用于评估不同分子之间的结合概率和位点。分子对接表明，谷氨酸（GLU）、缬氨酸（VAL）、甘氨酸（GLY）和天冬氨酸（ASP）在铁结合中起着重要作用（图4B）。三维图显示，VDEVGGEA肽的GLU-7、ASP-2和GLY-5分别通过2.5 Å、2.5 Å和2.6 Å三种金属-蛋白质复合力结合铁离子。VDEVGGE肽的ASP-2、GLU-3和VAL-4分别通过2.4 Å、2.5 Å和2.5 Å三种金属-蛋白质复合力结合铁离子。DEVGGE肽的ASP-1和GLU-2分别通过2.2 Å和2.5 Å两种金属-蛋白质复合力结合铁离子。在能量方面，铁与VDEVGGEA，VDEVGGE和DEVGGE肽的结合能分别为-0.84 KJ/mol，-0.84 KJ / mol和-1.67 KJ / mol（图4B）。通常，当大分子对接的结合能低于0时，配体和受体可以自发地相互连接。ITC的实验证实了这一点。因此，VDEVGGEA、VDEVGGE和DEVGGE肽可以自发地结合铁。

图5 特定肽对INT407细胞的活性和铁水平的影响

（A-C）合成肽对细胞活性的影响；（D）INT407细胞铁吸收量

在浓度为0.0625 mg/mL至1.0 mg/mL时，三种肽均未降低INT407细胞的活性（图5A-B，P > 0.05）。然而，随着浓度的增加，VDEVGGE肽首先增加细胞活性，然后降低（图5B，P < 0.05）。与空白组相比，0.25 mg/mL VDEVGGE肽将INT407细胞活性提高至121.87%。DEVGGE肽对INT407细胞活性没有显示出一致的趋势效应（图5C）。进一步的铁吸收实验表明，VDEVGGEA、VDEVGGE和DEVGGE肽促进了INT407细胞的铁吸收（图5D，P < 0.05），但三种肽之间没有观察到显著差异（图5D，P > 0.05）。考虑到血红蛋白水解产物中肽的丰度及其在消化过程中的稳定性，VDEVGGEA和VDEVGGE肽是血红蛋白水解产物中消化过程中能自发结合铁并促进铁吸收的关键肽，而DEVGGE肽是血红蛋白水解产物中促进铁吸收的重要序列。

血红蛋白作为猪屠宰血副产物中的主要蛋白质，含有丰富的功能性肽，如酶解后暴露出的促进铁吸收肽。在该研究中，血红蛋白水解物可能在消化过程中通过羧基、咪唑基团和芳香族氨基酸残基自发地结合铁，从而提高小鼠的血铁水平。血红蛋白水解产物中的VDEVGGEA和VDEVGGE是结合铁离子和促进铁吸收的主要肽，DEVGGE作为血红蛋白水解肽的公共序列发挥铁强化活性。

Xue, D. J., Jiang, S., He, H., Lametsch, R., Zhang, M., Li, C. B. Hemoglobin hydrolyzate promotes iron absorption in the small intestine through iron binding peptides. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2024, 72(27): 15237–15247.

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.4c00364

Food Science and Human Wellness丨水解血红蛋白作为非血红素铁强化剂的有效性和安全性评价

文字：薛德奖

校编：张   淼

 排版：吴美红

 审核：李春保