家畜和家禽宰后胴体将经历复杂的生理和生化过程。在此过程中，肌肉细胞的氧供应被切断，随后出现细胞凋亡和肌原纤维蛋白降解。细胞凋亡是一种受细胞内外信号影响的活跃且高度有序的细胞死亡过程，主要通过3条途径发生：外源性死亡受体途径、内源性线粒体途径和内质网应激途径。研究表明，宰后出现的缺氧和缺血具有通过线粒体途径诱导肌细胞凋亡的能力。近年来，线粒体介导的细胞凋亡在肉类科学领域受到越来越多的关注。肉品的嫩度、保水性、弹性等食用特性极大地影响了消费者的感官体验和肉制品的价值。与牛和羊等家畜相比，家禽，尤其是鸡肉，宰后期间肉品质量变化更快。近年来，有学者逐渐开始关注钙蛋白酶（calpain）对细胞凋亡的影响；然而，较少有研究关注calpain对宰后肌肉细胞凋亡的影响及其机制。
合肥工业大学食品与生物工程学院徐宝才教授团队在Food Chemistry期刊上发表了题为New perspective for Calpain-Mediated regulation of meat Quality:Unveiling the impact on mitochondrial pathway apoptosis in post-mortem （钙蛋白酶调节肉质的新视角：揭示宰后对线粒体途径凋亡的影响）的研究论文。该研究目的是探讨calpain影响肌肉细胞凋亡的机制，并阐明这一过程对宰后肉类品质变化的潜在影响。
研究成果
钙蛋白酶活性和溶酶体稳定性
通过蛋白质印迹（WB）评估死后钙蛋白酶的自溶作用。如图1AB所示，与对照样品相比，用calpain抑制剂（calpain inhibitor，Cal-In）处理组在宰后期间显示出更完整的μ-calpain条带。溶酶体稳定性与细胞凋亡密切相关。因此，本研究进一步确定了死后抑制钙蛋白酶对溶酶体膜稳定性的影响。结果（图1C）表明，溶酶体膜的稳定性随着死后时间的延长而显着下降。同时，在尸检期间，与对照组相比，Cal-In组具有更高的溶酶体膜稳定性。此外，结果还表明，通过抑制钙蛋白酶活性可以显着延迟溶酶体膜破裂的速度。这一发现意味着溶血在死后期间的一些不稳定可能受到钙蛋白酶的显著影响。
图 1. 宰后期间钙蛋白酶活性和溶酶体稳定性的变化。(A) 宰后鸡肉样品的μ-calpain免疫印迹图。(B)A组的条带灰度分析；(C)宰后溶酶体膜稳定性的变化；(D)钙蛋白酶破坏溶酶体膜并随后释放蛋白酶的示意图。（钙蛋白酶抑制剂和对照组之间的差异用大写和小写字母表示。*和**代表同一死宰后时间两组之间的差异。*，p<0.05；**，p<0.01下同。）
线粒体结构
随着宰后时间的延长，线粒体的结构逐渐发生变化，如图2D所示。宰后 0 小时，线粒体具有透明、完整的外膜和内部整齐排列的长而均匀的嵴。尽管宰后12小时，样品中的线粒体膜仍然完整，但观察到明显的线粒体肿胀。TEM结果显示，与 Cal-In-24 h 样品相比，CO-24 h 样品中线粒体肿胀更为明显。此外，CO-24 小时样品的线粒体外膜表现出部分破坏。此外，对于CO-48 h样品，线粒体膜受到严重影响，大部分嵴解体，线粒体结构几乎被破坏。总体而言，TEM结果表明，随着死后时间的延长，CO样品的线粒体结构逐渐被破坏。这些结果进一步验证了图2A中线粒体膜通透性和肿胀的死后变化。然而，在死后（0-48小时）期间，与对照样品相比，Cal-In样品表现出更慢的线粒体降解过程和更保存的线粒体结构。这一发现进一步证实了钙蛋白酶作为死后线粒体损伤的因素之一的作用
图2.宰后鸡骨骼肌线粒体状态和活性氧（ROS）含量的变化。(A)宰后线粒体肿胀和线粒体膜通透性变化（值越低代表线粒体肿胀和通透性越大）；(B)不同宰后时间线粒体中细胞色素C减少的程度；(C)不同鸡样品的ROS含量；(D)不同宰后时间线粒体（红色）的 TEM 图像（i，Cal-In-0 小时；ii，CO-0 小时（宰后0小时的对照处理）；iii，Cal-In -12 小时；iv，CO-24 小时；vi，CO-24 小时；viii，CO-48 小时）（Cal-In-xx 小时）代表不同宰后时间的钙蛋白酶抑制剂处理；CO-xx h代表不同宰后时间的对照处理）。
免疫印迹分析
通过蛋白质印迹（WB）检测宰后线粒体中bax和bcl-2蛋白含量的变化，进一步分析抑制钙蛋白酶活性对线粒体稳定性的影响机制。如图3所示，随着死后时间的延长，bcl-2蛋白水平逐渐下降。特别是，在宰后24-48 小时内，Cal-In样品中bcl-2的完整性比CO样品中的完整性高约9.70 %-21.34%。同时，随着宰后时间的延长，线粒体中bax水平显著升高。CO组bax蛋白的表达高于Cal-In组。CO 样品在死后比 Cal-In 样品有更多的 bax 蛋白表达，表明钙蛋白酶抑制可以抑制 bax 激活。随后，评估线粒体中促凋亡因子Cyt c和凋亡诱导因子 (aif) 含量的变化。结果显示线粒体中的两种蛋白质具有相似的趋势，它们的含量在整个死后阶段逐渐减少。Cal-In处理可抑制宰后线粒体中Cyt c和凋亡诱导因子（aif）含量的下降。宰后，肌浆中Cyt c含量先增加后降低。值得注意的是，CO组宰后0～24 h的肌浆中Cyt c含量高于Cal-In组。然而，宰后36～48 h，Cal-In组肌浆Cyt c含量较高。
图 3. Cal-In 和 CO 处理对不同宰后时间点鸡肉线粒体蛋白含量的影响。(A) 宰后鸡线粒体样本中 Bax 的蛋白质印迹图像；(B) 宰后鸡线粒体样本中 Bcl-2 的蛋白质印迹图像；(C) 宰后鸡线粒体样品中 Cyt c 的蛋白质印迹图像；(D) 宰后鸡线粒体样本中 Aif 的蛋白质印迹图像；(E) 宰后鸡样本肌浆中细胞色素c的蛋白质印迹图像；(F-I) Bax、Bcl-2、Cyt c、Aif蛋白条带的灰度分析。(J) Cyt c (肌浆中)蛋白条带的灰度分析；(K) 说明钙蛋白酶对死后鸡线粒体线粒体破坏的影响的示意图。
Caspase-3 活性
根据图4B，对照组的caspase-3活性在死后0-12小时内显著增加，并在此时达到峰值。然而，Ca-In组的caspase-3活性在死后0至24小时内显著增加，并在死后24小时达到峰值。同时，与 CO 组相比，Cal-In 组的 caspase3 活性较低。HE染色观察不同死后时间肌肉形态和核状态的变化。如图4A所示，死后0-12小时样本的肌纤维排列紧密，核形态正常。值得注意的是，随着死后时间的延长，染色质逐渐充满整个细胞核并聚集在核壁附近，表明细胞凋亡的发生。而且，随着宰后时间的延长，肌纤维之间的间隙逐渐增大。量化 TUNEL 染色的结果，如图 4D 所示，宰后0～6 h凋亡细胞比例变化不大，12～48 h明显增加。同时，宰后0～48 h，Cal-In组阳性计数均低于CO组。宰后12～48 h，CO组样本的凋亡程度比Cal-In组样本的凋亡程度高16.76%～22.02%。
图 4. Cal-In 和 Co 处理对宰后鸡肌肉细胞凋亡的影响。(A) 鸡肌肉样品的苏木精和伊红染色；(B) 鸡样本中 caspase-3 活性在宰后进展过程中的时间变化；(C) 使用 TUNEL 检测在不同的死后时间点捕获鸡样本细胞核的照片；(D) TUNEL 阳性细胞核（绿色）相对于 C 组细胞核总数的百分比。
肌原纤维蛋白降解
如图5A-C所示，在所有样本中，随着宰后时间的延长，肌间线蛋白降解明显增加。此外，如图 5B-D 所示，宰后0～48 h，CO组肌间线蛋白降解片段的数量明显多于Cal-In组和Cas-In组。此外，CO组完整的肌钙蛋白T（troponin T，Tn T）条带最少。相比之下，Cal-In组的样本宰后24～48 h表现出更高的Tn T完整性。
图 5. 鸡死后肌间线蛋白和肌钙蛋白 T (TnT) 水平的变化。(A) 宰后鸡样本中肌间线蛋白蛋白免疫印迹图；(B) 宰后鸡样本中 Tn T 的蛋白质印迹图像；(C) 肌间线蛋白蛋白条带灰度分析；(D) Tn T 蛋白条带的灰度分析。
Warner-Bratzler剪切力
研究了 Cal-In 和 Cas-In 处理样品的死后剪切力变化，以评估肌原纤维蛋白降解和细胞凋亡对肉嫩度的影响。结果表明，随着宰后时间的延长，所有样本的剪切力逐渐减小。宰后0～6 h，酶抑制剂组和CO组的剪切力无显著差异。
图 6. 分别用 Cal-In、Cas-In 和 CO 孵育的鸡肉样品在不同宰后时间点的 Warner-Bratzler 剪切力 (WBSF) 值
总结
总之，本研究的结果表明，钙蛋白酶在宰后参与破坏线粒体膜并触发线粒体途径凋亡。此外，本文表明钙蛋白酶可以通过调节细胞凋亡和肌原纤维蛋白降解来影响宰后肉的嫩度。具体而言，与肌原纤维蛋白降解相比，钙蛋白酶诱导的细胞凋亡对宰后鸡的嫩度变化产生更显着的影响。
✦
原文链接
✦
Ma Y, Wang Y, Wang Z, et al. New perspective for Calpain-Mediated regulation of meat Quality: Unveiling the impact on mitochondrial pathway apoptosis in post-mortem[J]. Food Chemistry, 2024, 441: 138287.
✦
推荐阅读
✦
Meat Science│超声波处理牛肉可提高细胞内钙离子浓度并诱导线粒体功能障碍，从而改善钙蛋白酶-1自溶和半胱天冬酶-3活性
文字：蒋欣媛
校编：张 淼
排版：陈天龙
审核：李春保
