多年来，牛肉一直是消费者的首选，这是由于它具有无与伦比的风味和大理石花纹。肌内脂肪（IMF）含量是评估肉质的关键因素，已成为一个重要的经济特征。因此，通过生物育种、稳定后代遗传提高IMF含量，可以改善牛肉的风味和肉质。然而，影响牛肉IMF含量的潜在调控机制尚不明确。
西北农林科技大学动物科技学院的Hengwei Yu（第一作者）在Journal of Agricultural and Food Chemistry发表题为Comprehensive analysis of transcriptome and metabolome reveals regulatory mechanism of intramuscular fat content in beef cattle（转录组和代谢组综合分析揭示肉牛肌内脂肪含量调控机制）的研究性论文。作者选择了24月龄的秦川牛（Q，n=6）、南阳牛（N，n=6）和日本黑牛（J，n=6）为研究对象，结果显示，J组的IMF含量明显高于中国本土牛，J组的单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸高于Q组，肌酸、赖氨酸和谷氨酰胺是牛肉中含量最高的三种氨基酸，与IMF含量相关的基因也富集在四个重要的KEGG通路中，包括脂肪酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、脂肪酸延长和胰岛素抵抗。此外，加权基因共表达网络分析（WGCNA）显示，ITGB1是与IMF含量相关的关键基因。这项研究比较了本地牛种和高IMF牛种的转录组和代谢组，为本地牛的育种和牛肉品质的改善提供了数据支持。
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图1 IMF转录组和表型的基础分析（n = 6）。（A）秦川牛（Q）、南阳牛（N）和日本黑牛（J）三个品种的IMF含量比较。（B）主成分分析。（C）样本相关性热图。（D）表示三个品种间基因数量比较的维恩图。
如图1所示，N组（12.35±1.22%）和Q组（13.38±1.08%，P=0.34）之间没有显著的统计学差异。然而，J组（16.92±1.08%）的肌内脂肪含量明显高于N组和Q组。此外，在主成分分析（PCA）中，每个品种的样本都聚集在一起，通过PCA1将日本黑牛与中国本土品种区分开来。基因表达具有组织特异性，三个品种的RNA-seq分析共获得10434个基因，共享基因比例为83.21%。
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图2 三个品种间的差异表达基因（DEGs）。（A）三组中差异表达基因数量的柱状图。（B）N vs J火山图。（C）Q vs J火山图。（D）Q vs N火山图。
图3 不同组间DEGs的功能注释分析。（A）N和J之间DEGs的GO富集分析；（B）N和J之间的GO富集分析；（C）N和J之间DEGs的KEGG富集分析；（D）Q和J之间的KEGG富集分析。
图4 直方图表示不同品种牛中DEGs通过FPKM和qRT-PCR的相对表达水平。左侧y轴为RNA-seq的FPKM值（红色），右侧y轴为qRT-PCR的相对表达水平（浅蓝色）。（a）FABP4；（B）PLIN1；（C）ACAA2；（D）ECHS1；（E）HACD2；（F）HSD17B12；（G）HSDL1；（H）PPT1；（I）SCD5；（J）ACAT1；（K）FASN；（L）ELOVL6。
如图2所示，在N组和J组之间有1613个差异表达基因（DEGs），其中897个基因上调716个基因下调。Q组和J组之间也有2987个DEGs，其中1483个基因上调，1504个基因下调。此外，Q组和N组之间有668个DEGs，其中391个基因上调，277个基因下调。为了确定日本黑牛和中国土牛的DEGs功能，作者进行了GO和KEGG功能富集分析。如图3所示，两组牛的DEGs都主要参与生物过程中的生物调控、代谢过程和细胞过程。KEGG富集结果显示，这些基因大多富集于脂肪酸延长、脂肪酸代谢、脂肪细胞脂解调节、胰高血糖素、AMPK和PPAR信号通路。此外，作者还分析了脂肪酸代谢相关通路中重要基因的表达，发现日本黑牛中 FABP4、PLIN1、ACAA2、ECHS1、HACD2、HSD17B12、HSDL1、PPT1、SCD5、ACAT1、FASN和ELOVL6的表达量高于秦川牛和南阳牛，qRT-PCR验证测试结果也与RNA-seq数据趋势一致（图4）。这些发现为育种者关注肉牛的 IMF 沉积提供了丰富的理论依据。
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图5 不同品种牛的差异表达代谢物（DEMs）。（A）主成分分析。（B）三组中DEGs的数量。（C）比较三个牛种的DEMs数量。（D）N vs J火山图。（E）Q vs J火山图。（F）N vs Q火山图。
图6 DEGs和DEMs的KEGG通路。（A）N与J之间 KEGG 的前30个重要通路；（B）N与J之间KEGG的前30个重要通路；（C）Q与J之间DEGs与DEMs的相关网络。
通过对18个样本进行代谢组学和定量分析，作者共发现了10720个峰，注释了3204个代谢物。结果表明，组间样本的总体代谢物差异较大，组内差异较小。在N组和J组之间有870个DEMs，其中427个代谢物上调，443个代谢物下调；在Q组和J组之间有894个DEMs，其中426个代谢物上调，468个代谢物下调；Q组和N组之间有622个DEMs，其中385个代谢物上调，237个代谢物下调。此外，日本黑牛肌肉中甘油三酯含量的log2FC是秦川牛的几十倍，是南阳牛的两倍。甘油三酯主要储存在脂肪组织中，而甘油二酯是合成甘油三酯分解代谢的重要中间产物，这表明IMF含量可能与甘油三酯和甘油二酯的水平和代谢有关。DEMs参与了卟啉代谢、氨基糖和核苷糖代谢以及亚油酸代谢途径。研究表明，脂肪酸，尤其是不饱和脂肪酸对肉的风味非常重要。
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图7 对三个牛种的IMF进行加权基因共表达网络分析（WGCNA）。（A）软阈值。（B）基因和模块划分的聚类树状图。（C）基因模块与IMF的相关性热图。（D）KEGG对 MEturquoise 中关键基因的富集分析。（E）MEturquoise 中前91个基因（度值大于20）的可视化。
图8 三个品种部分蛋白编码DEGs的表达。（A）Western blot检测增殖相关基因PPARγ、C/EBPα、SREBF1和FABP4的蛋白水平。（B）Western blot的定量数据经ImageJ定量后与抗-β肌动蛋白进行比较（**表示不同组间差异显著，P < 0.05）。
作者利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）来识别与目标性状相关的基因调控网络和关键基因。结果显示，MEturquoise与IMF之间的相关性最强（r=0.76，P<0.01），共有2589个基因聚类在该模块中。对MEturquoise中基因的KEGG富集分析表明，代谢途径、脂肪酸代谢、脂肪酸降解、脂肪酸延长和PPAR信号通路中的重要通路可能与IMF含量有关。从这些候选基因中，作者发现ITGB1、IL6、EHHADH、COL1A1、COL1A2、CXCR4和PPARG核心基因可能控制着IMF 含量。
通过 Western blot检测了PPARγ、C/EBPα、SREBF1和FABP4。日本黑牛背长肌中FABP4的表达水平最高，秦川牛次之，南阳牛最低。此外，Q组和J组中PPARγ和SREBF1的表达水平也高于N组。相反，在南阳牛中，C/EBPα的表达水平最高。PPARγ和C/EBPα是成脂分化的关键转录调节因子，也是成脂分化途径的主要靶基因。总之，这些结果确定了有助于当地牛资源开发、牛育种和优质牛肉生产的关键调控基因、代谢物和途径。
原文链接
Yu H W, Yu S C, Guo J T, et al. Comprehensive analysis of transcriptome and metabolome reveals regulatory mechanism of intramuscular fat content in beef cattle. Journal Of Agricultural and Food Chemistry, 2024, 72(6): 2911–2924.
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文字：侯玉澄
校编：张 淼
排版：董梓桐
审核：李春保
