关于胶原蛋白,上期我们与您探讨了其纯化工艺并介绍了我们的解决方案,整体上介绍了切向流过滤和层析在胶原蛋白纯化中的应用,本期我们将进一步进行不同表达体系下胶原蛋白纯化工艺相关探讨。
胶原蛋白的三种制备方法中,除了化学合成法由于技术复杂、成本较高、无生物活性,仅限于实验室研究,动物源提取法和基因重组法都在商业规模得到广泛应用。动物提取胶原蛋白经济高效,广泛应用于食品和制药行业,但可能具有引起免疫源性反应的风险;而重组胶原蛋白通过模拟天然胶原蛋白中的翻译后修饰,如羟基化与糖基化,从而实现与人类胶原蛋白高度相似性,兼具安全性高,无免疫排异,批次稳定,生产规模可放大的优势[1],占据胶原蛋白市场主导地位。
为了生产重组胶原蛋白,表达系统的确立至关重要。目前已经探索了包括哺乳动物、昆虫、酵母、细菌细胞在内的多种表达系统,像CHO和HEK293等哺乳动物细胞的翻译机制与人类细胞最为相似,但是产量较低而成本较高阻碍了工业规模生产,而细菌与酵母表达系统更具成本效益,操作性强,适宜工业化生产[1]。
由此可见市面上的重组胶原蛋白主要是通过大肠杆菌和酵母表达,对于这两种不同表达系统的重组胶原蛋白,东富龙生物工艺耗材团队都能为您提供其下游纯化工艺解决方案,并且在重组胶原蛋白的分离纯化领域具有丰富的经验。
大肠杆菌表达系统的主要杂质是细胞代谢产物,比如宿主蛋白,内毒素等。对于胞内可溶表达的目标产物,首先要将菌体破碎,澄清过滤等前处理,再选用合适的层析方法提高目标产物纯度,离子交换层析应用较多,如目标物带有纯化标签可考虑先加一步亲和层析,我们推荐的工艺步骤如下图所示。
澄清
大肠杆菌破碎离心后仍有较多杂质,在上层析之前料液浊度需降低到至少20NTU以下。
图2. TanFlux® II PES 0.45μm澄清的过滤表现
该案例中使用TanFlux® II PES 0.45μm膜包澄清之后,料液浊度从82.4NTU降至1.05NTU,载量达到190L/m²,为后续纯化的顺利进行打好了基础。
层析
对于带His标签蛋白的重组蛋白,可首先考虑Ni离子亲和层析介质,配合离子交换层析实现纯化目的。
图4. 层析结果:终产品HPLC纯度图(左);
终产品SDS-PAGE纯度图(右)
表2.大肠杆菌表达胶原蛋白纯化案例相关填料产品信息
对于若不带有纯化标签的胶原蛋白,也可选择合适的离子交换层析介质或者多模式层析介质等,在工艺优化中充分考虑多种层析类型进行搭配组合,逐渐优化以达到理想的目标。
毕赤酵母是一种真核细胞表达系统,其特点为表达量较高,并且由于其为分泌表达,所以不需要有细胞破碎的过程,发酵液收获后可通过过滤或离心去除大部分杂质,使用超滤膜包进行料液的浓缩换液,层析纯化选择疏水层析为多,可再加一步混合模式层析精纯,如下图工艺路线所示:
层析
该案例为毕赤酵母表达系统表达的胶原蛋白,经过工艺优化,最终确定的色谱层析工艺为Phenyl Purose 6FF(HS)疏水层析捕获结合Rigose MMC Hires阳离子复合模式两步法。结果下图所示,最终得到纯度96%,收率90%的目标产物,满足实际生产要求。
图6. 疏水层析Phenyl Purose 6FF(HS):层析图谱(左),
SDS-PAGE纯度图(右)
图7. 多模式层析Rigose MMC Hires:层析图谱(左),
SDS-PAGE纯度图(中),HPLC纯度图(右)
表3. 毕赤酵母表达胶原蛋白纯化案例相关填料产品信息
由于不同的胶原蛋白的理化性质不同,纯化要求也不同,层析工艺可根据具体情况选择,疏水层析,离子交换层析和混合模式层析都在可选范围内,其中疏水层析应用较多,其他案例中也可通过一步Phenyl Purose 6FF疏水层析得到纯度>90%,收率>70%的目标产物,适用于化妆品,原料制备,二类医疗器械生产项目。
浓缩换液
层析纯化后的料液需通过超滤进行浓缩换液,提高样品浓度以及换液脱盐。
图8. TanFlux® II PES 10KD浓缩换液过滤表现
该案例中使用TanFlux® II PES 10KD浓缩换液,浓缩4倍后透析5倍除去一些小分子色素,平均通量约110LMH,收率高达98.9%。
动物源胶原蛋白是以动物组织(猪、牛、鱼)通过前处理,酸法、碱法、酶法溶出,纯化制备的具有天然胶原完整蛋白片段和三螺旋结构的胶原蛋白,在结构上保证胶原蛋白的生物学活性。一般生产工艺如下图所示:
浓缩换液
该案例中使用TanFlux® II RC 100KD浓缩换液,浓缩4倍后透析3倍除去一些小分子蛋白,平均通量约19LMH,收率达89%。
层析
其中,层析纯化过程为动物源胶原蛋白纯化的关键步骤,如下案例中,经东富龙弱阳离子交换介质CM Purose 6FF层析后的结果如下图所示,除杂效果明显,处理量较为可观,为工业化制备动物源胶原提供了较优的解决方案。
图11.CM Purose 6FF层析图谱(左),SDS-PAGE纯度图(右)
表4. 动物源提取胶原蛋白纯化案例相关填料产品信息
参考文献
[1]叶滔, 项琪, 杨艳, 黄亚东. 胶原蛋白的开发与应用研究进展[J]. 生物工程学报, 2023, 39(3): 942-960.
东富龙(股票代码300171)成立于1993年,2011年创业板上市,总部位于上海,是一家为全球制药公司提供工艺服务与耗材、核心装备及工程的整体解决方案服务商。东富龙秉承“天道酬勤”核心价值观,坚守“专业技术服务于生物医药”的使命,以“系统化、国际化、数智化”的发展战略,不断前行。
东富龙拥有四个核心事业部:生物工艺事业部、制剂装备事业部、工程事业部、食品工程事业部。迄今有东富龙生命科技、东富龙德惠等26家境内控股子公司,13家境外控股子公司,国内外共8个基础制造基地,拥有中国、美国、德国3个全球研发中心,东富龙持续加强药物制造科学和药机科学制造的研究,致力打造“下一代的药物制造平台”,为研发、中试及商业化生产的客户提供专业解决方案,助力药物快速研发及大规模商业化生产。