NK免疫细胞治疗技术作为细胞治疗主要技术之一，在人机体健康及癌症治疗方向被广泛研究应用。不同于CAR-T细胞治疗技术，NK细胞治疗对实体瘤同样有效。NK免疫原性低、异体移植安全性高，具备更高的通用性，可以作为现货型细胞治疗产品进行规模化大批量生产。
NK细胞治疗技术由来已久，未进行基因改造的NK作为个性化细胞治疗技术在临床医疗技术中应用数十年，安全性和有效性经过长期验证。随着细胞治疗技术的不断进步，NK细胞治疗技术呈现多元化发展趋势。
细胞样本种子来源方向：种子细胞来源由新鲜脐血、外周血、新增单采冻存PBMC及iPSC来源。
NK治疗技术方向：基于自然NK细胞的技术工艺，新开发获得经基因修饰改造的CAR-NK细胞治疗技术。
生产及应用端方向：NK细胞治疗自体小规模个性化治疗技术，创新获得批量化通用性现货型NK细胞治疗技术产品。
NK细胞治疗技术发展同时存在诸多重大挑战及技术壁垒，在NK技术落地及产业化端，如何进行高纯度的NK激活扩增首当其冲，其次是大规模生物反应器扩增工艺以及NK的高效冻存技术。为解决以上问题，东富龙生物实验室建立“ATMP NK细胞药整体解决方案--培养基及应用技术、工艺设备及耗材”，以系统支持解决行业NK细胞规模化制备及产业化落地的挑战。
在“CulLymNK-KIT03--新一代 NK纯因子体系试剂盒”重点介绍了高纯度的NK激活扩增解决方案，本期为NK大规模生物反应器（2L~200L）扩增工艺解决方案。
开展NK生物反应器大规模培养的工艺技术团队已经了解NK在规模化放大上存在的挑战，NK细胞上生物反应器种子细胞要求，上生物反应器后细胞活性下降、细胞扩增缓慢、以及最终收获纯度低等问题直接影响NK规模化培养成功率，亟待解决。
东富龙生物实验室在不断试验总结中获得NK培养关键，上述问题都指向同一个根本原因，即NK的固有特性。相比较于T细胞，NK对培养环境要求更为严格且生长扩增呈现聚团生长，NK对环境更敏感，温度、剪切力、溶氧、pH等参数适应范围严格。因此T细胞大规模培养工艺无法有效转移到NK大规模培养。在生物反应器规模化培养过程中，提升NK对环境的适应能力并创造适宜的生长环境是解决NK规模化扩增的关键。
二、NK大规模培养专用增强剂
--Tobitec ® NK Expansion Enhancer
NK Expansion Enhancer（Tobitec ®），ML601-50
NK扩增增强剂，无血清无异源成分添加剂
为NK细胞大规模生物反应器扩增培养、解决NK规模化扩增问题而专门开发。该增强剂化学成分明确，不含任何外源性生长因子及不明确的添加成分，在生物反应器培养模式下补充促进剂，能够有效提高NK细胞生物反应器的适应能力，提升NK细胞生长扩增状态及稳定性。
产品性能优势
✓ 提升NK生物反应器规模化扩增培养。
✓ 化学成分明确，不含任何外源性生长因子及不明确的添加成分。
✓ 有效提高NK细胞生物反应器体系的适应能力，提升NK大规模培养成功率。
✓ 显著提升NK的活性增殖能力，提高NK总体扩增倍数及终产品品质（最终纯度及活性活力）。
NK Expansion Enhancer（Tobitec ®）功能试验
测试目标：通过对比不同组别（低转速角度、高转速角度、高转速角度+NK Expansion Enhancer）NK培养效果，验证测试NK Expansion Enhancer在生物反应器规模下的生长支持能力。
测试方案：将NK种子细胞按1E6/mL，初始接种量200mL接种至Tofflon CES-10L 细胞扩增系统&Tofflon 2L细胞培养袋。根据组别设定不同条件，控制其它参数条件一致进行NK培养。当细胞活性低于80%或者培养至D8收获NK细胞，进行细胞活性、纯度及扩增倍数对比。
试验结论：
1、NK波浪式生物反应器培养，对比一般静态CO2培养模式在培养模式上发生根本变化，NK扩增速度及NK纯度受波浪式生物反应器参数影响显著。
2、在不添NK Expansion Enhancer情况下，相较于高角度转速组NK快速死亡无法扩增，低角度转速下，NK转WAVE生物反应器后，NK可以有限扩增，细胞活性缓慢下降，NK纯度显著低于CO2静置培养条件。
3、高角度转速&5% NK Expansion Enhancer组，在培养周期内，NK细胞维持高活性并可实现稳定快速的细胞扩增，NK纯度达到CO2静置培养条件相同水平。
三、Tobitec ® NK Expansion Enhancer
应用技术案例
案例背景
样本类型：冻存PBMC
培养基：Tobitec ® NK培养基套装（CulLymNK-KIT03）+Tobitec ® NK Expansion Enhancer
培养模式：CO2培养箱静置培养（前期）& CES波浪式生物反应器动态培养
设备耗材：Tofflon CES-10L 细胞扩增系统&Tofflon 2L细胞培养袋（XPD-T-2LA1，2L，非灌流）
工艺流程
按Tobitec ® NK培养基套装（CulLymNK-KIT03）指导说明书进行，使用CulLymNK-KIT03 NK激活培养基进行PBMC激活诱导，在CO2培养箱静置培养，使用激活培养基培养至D7。
按照1E6密度补充NK扩增培养基，继续培养至D9。
D9，取样进行细胞计数，根据计数结果，按1E6/mL补充CulLymNK-KIT03 扩增培养基及5%Tobitec ® NK Expansion Enhancer，将种子细胞收集到500mL转种瓶中。
将种子细胞接种至Tofflon CES-10L 细胞扩增系统&Tofflon 2L细胞培养袋，接种密度为1E6/mL，初始接种体积为200mL。
设定生物反应器培养温度37℃， 5% CO2，转速6rpm，角度2°，通气0.1LPM（100ccm/min）。
每天取样检测NK细胞密度及活性。根据细胞密度按1E6mL进行扩增补加CulLymNK-KIT03 扩增培养基，直到到达满载培养量（培养转速和角度随培养体积的增加进行适应性调整）。
细胞收获，取样检测细胞密度、活性及NK纯度。
NK Expansion Enhancer增强剂应用于NK波浪式生物反应器条件下大规模培养，可有效促进支持NK细胞扩增，D8总体扩增倍数达22.1倍。此外，NK细胞活性可稳定维持在90%以上。
NK Expansion Enhancer增强剂应用于NK波浪式生物反应器条件下大规模培养，非灌流模式下细胞密度可达3.4E6/mL以上，能有效支持NK高密度培养。
NK Expansion Enhancer增强剂应用于NK波浪式生物反应器条件下大规模培养，可有效维持提高NK最终收获时纯度，纯度可达到和普通CO2静置培养相同水平，并可进行进一步应用优化以提升纯度。
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