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哮喘是一种常见的慢性气道炎症性疾病，具有异质性和复杂性，其病理生理机制至今尚未完全阐明[1]。重症哮喘是哮喘中最具挑战性的类型，其患者往往对标准治疗反应不佳，病情反复发作，严重影响日常生活，并造成医疗资源的负担[2]。嗜酸粒细胞型哮喘（eosinophilicasthma，EA）是重症哮喘中最常 见的炎症表型，中粒细胞型哮喘（neutrophilicasthma，NA）在重症哮喘中虽然不如EA 普遍，但NA患者 往往对糖皮质激素治疗不敏感，增加了重症哮喘的控制难度[3]。探索重症 EA、NA各自的特异性基因 表达模式和信号通路，揭示潜在的生物标志物，对于重症哮喘精准医疗的发展具有重要意义[4]。失巢凋亡是一种由细胞脱离其基质而引发的 程序性细胞死亡形式[5]。靶向失巢凋亡抗组织侵袭迁移、纤维化是目前前沿的研究热点[6]。哮喘患者的气道炎症和气道重塑结构变化可能导致上皮细胞与细胞外基质的接触丧失，触发失巢凋亡。失巢凋亡可能通过影响细胞外基质的组成和结构，使气道上皮细胞获得间充质细胞的形态和迁移能力，导致气道壁增厚和纤维化[7]，促进重症哮喘患者气道重塑的病理发展；同时，气道上皮细胞发生过度的失巢凋亡会破坏气道上皮屏障，增加哮喘易感性。然而，失巢凋亡在重症哮喘尤其是EA和NA气道 重塑中的具体作用机制尚未被充分研究。因此，探索失巢凋亡在重症EA和NA气道重塑中的作用机 制，挖掘具有诊断价值的生物标志物，对于理解重症哮喘的发病机制和揭示新的治疗靶点具有重要意义。筛选开发具有抗气道炎症生物活性的中药化合物是应对重症哮喘治疗挑战的重要策略，也是响应“十四五”中医药发展规划的现实举措。在高通量基因表达数据库（gene expressionomnibus，GEO）中检索“severe asthma”，筛选实验 设计来源于临床样本，取样方法为支气管活检，且包含EA、NA2 种不同气道炎症表型以及健康对照 样本的数据集。选择GSE143303 为目标数据集。通过lumi 包 读取illumia 测序 原始数据
，illuminaHumanv 4.db 注释探针文件，并通过normalizeBetweenArray函数进行矩阵标准化处理， 最后构建EA、NA 不同炎症表型与健康对照的分组 数据，利用FactoMineR 包、factoextr 包执行主成分 分析（principal
component analysis，PCA）。运用加权基因共表达网络分析（weighted correlationnetwork analysis，WGCNA）鉴定与重症EA、NA显著相关的关键模块。构建权重基因网络， 过滤低表达量基因及离散样本，设置 pickSoft Threshold中RsquaredCut 为0.85，最佳软阈值为系 统默认，模块内最少包含50 个基因。提取GSE14330 临床信息导入性状数据，分析不同样本和性状聚类情况，构建性状-模块相关性图，选择与EA、NA 相 关性最高的模块进行后续分析。1.3 失巢凋亡调控重症EA、NA的基因及通路鉴定失巢凋亡相关基因来自 GeneCards（https://www.genecards.org/）。将失巢凋亡基因与EA、NA 不同炎症表型的重症哮喘WGCNA 模块基因重叠，鉴定出发挥调控作用的失巢凋亡基因。重叠部分的基因通过蛋白质分析通过进化关系（proteinanalysis through evolutionary relationships，PANTHER ） （https://www.pantherdb.org/）进行通路注释和富集， 以探索潜在的调控机制。
1.4 失巢凋亡调控重症EA、NA 病理表型的关键靶 基因鉴定根据PANTHER 通路富集结果，筛选出失巢凋 亡靶向调控EA、NA不同炎症表型重症哮喘的潜在 病理表型。从GeneCards 获取病理表型相关基因进 一步与失巢凋亡调控基因取交集，并对交集基因在EA、NA中的表达量以及对气道炎症分型的诊断价 值进行表征，表征良好的基因被鉴定为关键靶基因。最后借助目前最全面的人类蛋白质图谱（humanprotein
atlas，HPA）数据库（https://www.proteinatlas.org/）收录的共识组织基因数据及单细胞转录组学数据对关键靶基因在人体组织及肺部细胞的转录本表达水平进行注释，探索基因在组织及肺部各细胞中的表达情况。
1.5 年龄、性别、吸烟与重症EA、NA发病与否结 局指标的预测评估提取GSE14330临床信息，包括年龄、性别和 吸烟情况，因仅有部分样本记载了烟龄，故予以剔除烟龄数据。利用survival 和rms 程序包，基于Cox 比例风险模型（coxproportional-hazardsmodel，COX）分析结果，以患病风险作为预测因子的结局。构建重症EA、NA患者不同炎症表型与年龄、性别、 吸烟情况3 个预测因子的诺莫图，并分别计算每个 预测因子的曲线下面积（areaunderurve，AUC）值， 绘 制 受 试 者 工 作 特 征 （ receiver operator characteristic，ROC）曲线进行模型评估。同时为评 估预测模型的判别能力，构建校准曲线对比模型预测概率和观测概率的一致性；构建决策曲线分析（decision
curve analysis，DCA）曲线观察随着阈概 率变化，按照模型预测值进行干预的情况下净获益的变化，验证诺莫图诊断预测性能。1.6 关键靶基因潜在的靶向中药化合物及结合亲和力鉴定通过TcmBank（https://www.tcmbank.cn/）查找 对关键靶基因具有潜在干预作用的中药化合物分子，通过ETCM（http://www.tcmip.cn/ETCM/）表征 化合物的药理、毒理学特性，借助 Cytoscape软件 构建关键靶基因与潜在中药化合物分子的关联网络，识别互作程度最高的化合物。随后通过 CB-Dock2执行关键靶基因与中药化合物配体的分子对 接，并基于AutoDockVina评估最佳结合位点的结 合亲和力。GSE143303 是患有重症哮喘不同炎症表型的患者和健康人的支气管活检标本的转录组测序数据，包括了22例EA患者、9例NA患者和 13例 健康对照者。PCA 是一种使用广泛的数据降维算法，能够直观展示组间数据的分布情况。结果显示，EA 与对照组、NA 与对照组的样本组成均有一定的分离性，不同炎症表型间展示出不同的样本分布情况（图1）。
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WGCNA 分析旨在寻找协同表达的基因模块， 并探索基因网络与临床表型之间的关联，以及模块中的核心基因。EA、NA不同表型的数据最佳软阈值分别是5 和10，在此条件下基因表达网络均符合 无尺度网络的分布（图2-A、B），且不同表型之间 样本和临床性状展示出不同的聚类特征（图2-C、D）。经鉴定，分别有7 个模块与EA、NA 密切相关 （图2-E、F）。其中，与EA正相关性最强的是黑色 模块（相关系数＝0.59），包含54 个基因；与NA 正 相关性最强的是蓝色模块（相关系数＝0.86），包含 212个基因。同时，模块与模块、模块与性状之间 关联显著（图2-G、H）。2.3 失巢凋亡基因参与整合素信号通路调控重症EA、NAGeneCards共收录919个失巢凋亡相关基因（数 据库访问时间：2024 年5月22 日），与EA正相关 性最强的黑色模块有5 个重叠基因，与NA 正相关 性最强的蓝色模块有 16 个重叠基因。分别对重叠基因进行PANTHER 通路富集，发现不同炎症表型 均在整合素信号通路上富集（图3-A、B）。整合素 信号通路是与哮喘气道重塑显著相关的途径。此外，失巢凋亡调控EA的基因还富集在血管生成、 成纤维细胞生长因子（fibroblastgrowthfactors，FGF）信号通路等与气道重塑同样相关的途径；失 巢凋亡调控NA的基因也在p53通路、磷脂酰肌醇3-激酶信号（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）激 酶通路等参与细胞增殖、凋亡过程的途径富集。由此可见，失巢凋亡可能通过参与整合素信号通路调控重症EA、NA的气道重塑病理表型。
GeneCards共收录 5503个气道重塑表型相关 基因（数据库访问时间：2024-05-22），与EA-失巢 凋亡有2个重叠基因，分别是活化C激酶 1受体 （receptor for
activated Ckinase1，RACK1）、蛋白磷 酸酶 2 调节亚基 Bα 亚型（proteinphosphatase2 regulatory subunitbalpha，PPP2R2A）（图4-A）；与NA-失巢凋亡有11 个重叠基因，分别是整合素亚基 β5（integrin
subunitbeta 5，ITGB5）、肿瘤坏死因子 受体超家族成员 1A（tumornecrosisfactorreceptor superfamilymember1A，TNFRSF1A）、细胞周期蛋 白D1（cyclin D1，CCND1）、血清/糖皮质激素调节 激酶 1（serum/glucocorticoidregulatedkinase 1，SGK1）、醛脱氢酶家族1 成员 A1（aldehyde dehydrogenase1familymember A1，ALDH1A1）、 醌氧化还原酶1[NAD(P) H:quinoneoxidoreductase 1，NQO1]、S100 钙结合蛋白 A8（S100calcium bindingprotein
A8，S100A8）、NME/NM23核苷二 磷酸激酶 1（NME/NM23nucleoside diphosphate kinase1，NME1）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（cyclin dependent kinase inhibitor1A，CDKN1A）、 三叶因子3（trefoilfactor3，TFF3）和干扰素α 诱导蛋白 27（interferonalphainducibleprotein27， IFI27）（图4-B）。其中，PPP2R2A 在重症EA 和对 照、重症EA和重症NA中均具有差异表达（图4- C）；ITGB5、CCND1、ALDH1A1、S100A8、NME1、TFF3和IFI27 在重症NA 和对照、重症NA 和重症EA中均具有差异表达（图4-D）。此外，重症EA 中PPP2R2A（AUC＝0.85）及重症NA中ITGB5（AUC＝0.93）、TNFRSF1A（AUC＝0.77）、CCND1 （AUC＝0.97）、ALDH1A1（AUC＝0.91）均展示出 极佳的诊断预测效能（图 4-E）。并且，PPP2R2A（AUC ＝0.70）、ITGB5（AUC ＝0.80）、CCND1（AUC＝0.83）、ALDH1A1（AUC＝0.87）在鉴别重 症EA和重症NA气道炎症表型具有良好价值（图4-F）。综上，失巢凋亡基因PPP2R2A 可能是调控重症EA气道重塑表型的关键靶基因；失巢凋亡基因ITGB5、CCND1、ALDH1A1可能是调控重症 NA 气道重塑表型的关键靶基因。这些基因在肺部的表达量相较于其他多数组织高（图5）。同时，基于人体的单细胞转录本数据提示 PPP2R2A在肺部多种 细胞表达，包括I型肺泡上皮细胞、II型肺泡上皮 细胞、粒细胞、巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞等；ITGB5则在平滑肌细胞表达最高，其次为成纤 维细胞和巨噬细胞；CCND1在I 型肺泡上皮细胞、II型肺泡上皮细胞及分泌细胞表达量丰富；在巨噬 细胞中高表达，其次为分泌细胞（图6）。调控肺组 织细胞中高表达的靶点，对于抑制气道上皮细胞向间充质细胞的转化及成纤维细胞的增殖具有重要意义。
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2.5 年龄、性别、吸烟在重症EA、NA的诊断预 测价值GSE14330 记载的临床数据包括年龄、性别、吸 烟。其中吸烟分为不吸烟者和曾经吸烟者。为判断以上因素在重症哮喘气道重塑发病中的影响情况，通过诺莫图观察其单独评分标尺，通过计算预测因子表达评分之和来判断其在重症哮喘气道重塑发展中的风险率。同时绘制ROC 曲线、校准曲线、DCA决策曲线评价模型稳健度。结果提示，年龄、 性别在重症 EA、NA 患者中的发病风险预测均＞50%（图 7-A、B）。ROC结果提示，年龄在重症EA、NA表型中的诊断价值最高（AUC值均＞0.7），且 在NA中的诊断性能优于EA（图7-C、D）。校准曲线提示，诺莫图的总体拟合良好，预测概率与实际概率较吻合（图7-E、F）。DCA决策曲线提示，年 龄、性别、吸烟3 个因素对重症EA、NA患者发病 的合并影响大于任一因素的影响（图7-G、H）。
2.6 潜在干预重症EA、NA 气道重塑中失巢凋亡的 中药化合物本研究揭示了重症哮喘患者中失巢凋亡基因PPP2R2A、ITGB5、CCND1 和在不同炎症表型气道重塑过程中的关键作用。通过综合分析，识别出59 种与这些基因相互作用的中药化合物分子，其中水飞蓟素（C25H22O10）、花生四烯酸（C20H32O2） 和熊果酸（C30H48O3）显示出与这些基因高度的互作性（图8-A）。这些化合物来源于降气化痰药、散 结化痰药、清热解毒药以及活血散瘀药等，反映了中医药侧重通过化痰、散瘀法治疗哮喘气道重塑的思想，同时侧面说明了“痰、瘀”病理因素在气道重塑发病中的重要作用。同时，水飞蓟素、花生四烯酸、熊果酸高药物血浆蛋白结合率（＞95%）和 低人体肝毒性的药动学特性及毒理学特性也支持了上述化合物在安全有效治疗重症哮喘气道重塑方面的潜力（图8-B）。此外，进一步的分子对接分 析验证了这些中药化合物与失巢凋亡基因之间的结合亲和力（图9）。其中水飞蓟素与PPP2R2A、ITGB5、CCND1的结合亲和力评分均超过−9，表明 其可能在调控气道重塑中发挥重要作用。花生四烯酸和熊果酸虽然亲和力略低于水飞蓟素，但评分均超过−6，仍具有良好的结合潜力。![]()
重症哮喘是指在过去的1 年中，需要使用全球哮喘防治创议建议的第4 级或第5 级哮喘药物才能够维持控制，或即使在上述治疗下仍表现为“未控制”的哮喘[8]。虽然重症哮喘患者人数仅占哮喘患 病人数的小部分，但重症哮喘急诊就医率和住院率分别为轻中度哮喘患者的数十倍，也是哮喘致死的主要原因[9]。炎症细胞内流浸润气道导致炎症不消退是哮喘难以控制的重要原因，而不同的炎症表型在重症哮喘中展示出不一样的病理特点，所导致的疾病严重程度不一。目前，重症哮喘的抗炎治疗，如吸入性皮质类固醇主要对气道嗜酸性粒细胞增多敏感[10]，而NA 对糖皮质激素无效或耐药，并且 可以通过上调相关炎症因子的表达使哮喘更难以 控制[11]。提示针对重症哮喘不同炎症表型的研究对于控制急性发作率和治疗具有重要临床意义。因此，探索不同哮喘表型的分子特征，可以为哮喘靶向治疗提供更加针对性的选择。![]()
失巢凋亡是一种特殊形式的程序性细胞死亡，是由细胞与细胞外基质或其他相邻细胞失去接触而导致的细胞凋亡。在正常生理条件下，失巢凋亡可防止细胞在不适宜的地方生长从而维持组织稳态[12]。然而，在病理条件下，过度的失巢凋亡可能 会导致细胞异常增生和迁移，进而促进病理发展。本研究提示，在重症哮喘中失巢凋亡可能通过整合素信号通路介导气道重塑。气道重塑是重症哮喘的关键病理特征，与病情的严重程度和预后密切相关。气道重塑包括气道壁增厚、平滑肌增生、气道上皮下基质沉积导致的上皮下纤维化等病理改变，最终导致气道狭窄和气流受限，显著影响哮喘患者的气道功能。研究表明，上皮间充质转化（epithelialmesenchymaltransition，EMT）的激活是气道重塑的 关键，在此过程中，上皮细胞获得间充质细胞的特征，细胞运动性和迁移能力增强，促进气道重塑的发展[13]。值得注意的是，失巢凋亡通过调控细胞的 生存和迁移参与 EMT过程。本研究发现失巢凋亡 在重症EA、NA的病理机制可能与整合素信号通路 密切相关。整合素是一类介导细胞与细胞外基质相互作用的跨膜受体，整合素信号通路的激活同样促进细胞的黏附、增殖和迁移，导致气道重塑、血管生成、肺纤维化等肺结构改变。诱导黏附的整合素信号传导可以抑制失巢凋亡的发生[14] ，同时促进气 道上皮细胞的EMT[15]。因此，失巢凋亡在重症哮喘 气道重塑中发挥重要作用，其机制可能与整合素信号通路介导的EMT 有关。![]()
PPP2R2A 作为蛋白磷酸酶 2A 的调节亚基之 一，参与细胞增殖、DNA复制、凋亡和细胞迁移的 多种激酶和信号通路[16]。PP2R2A增强Th17细胞 的分化[17] ，而 Th17 又通过分泌白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）等细胞因子参与免疫反应及EA气道炎症和气道重塑[18-19]。另外PPP2R2A 是间 隙连接蛋白Cx-43及紧密连接蛋白Zo-1维持表皮 屏障功能的必需因素[20]。ITGB5 是细胞表面的一种整合素受体，ITGB5 增强中性粒细胞与血管内皮细胞的黏附，加剧炎症反应[21]，并且ITGB5 可通过参 与气道上皮细胞的增殖和迁移，影响气道结构的重塑过程，进而影响NA[22]。CCND1 是细胞进程的关 键调节因子，在细胞增殖和迁移中起关键作用[23]，能够促进气道上皮细胞和成纤维细胞的增殖，导致气道壁增厚和平滑肌增生，从而促进气道重塑的发展。ALDH1A1是一种参与细胞分化和抗氧化反应 的酶，它在维持细胞功能和抵御氧化应激中起着重要作用[23]。在NA中，可能通过减少氧化应激，减 轻炎症细胞的活化和炎症介质的释放，保护气道细胞免受炎症损伤，从而减缓气道重塑进程[24-25]。综上，PPP2R2A可能通过增强Th17 细胞的分化诱导重症 EA 气道重塑的加重；ITGB5、CCND1 和ALDH1A1可能是从参与气道上皮细胞的增殖和迁 移、促进气道上皮细胞和成纤维细胞的增殖促进重症NA的气道重塑进程。![]()
水飞蓟素是从中药水飞蓟中提取的一种黄酮木脂素类化合物，其显著抗氧化、抗炎、抗纤维化的药理作用，使其具有良好的清热解毒功效[26-28]。研究表明，水飞蓟素能够降低哮喘小鼠模型中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞细胞数量及IL-4、IL-5 和IL-13 等炎症因子含量[26]。重要的是，水飞蓟素可以显 著抗肺部纤维化，抑制肺组织中的胶原沉积及气道 重塑的经典标志物TGF-β1的表达[29] ，并在抑制细 胞增殖、迁移、侵袭和EMT潜力巨大[30]。研究表 明，水飞蓟素可以通过阻断纤维连接蛋白1 （fibronectin1，FN1）/蛋白激酶B（proteinkinaseB，Akt）信号通路，下调CCND1的表达以降低EMT 相关标志物如Snail、Slug的表达[31]；通过降低和基 质金属蛋白酶9（matrixmetalloproteinase 9，MMP9）的蛋白和mRNA 表达发挥抑制细胞增殖、迁移和侵 袭能力的药理作用[32]。遗憾的是，目前并没有水飞 蓟素与PPP2R2A、ITGB5相互作用的直接证据。 花生四烯酸是一种重要的人体必须脂肪酸，也是人体中含量最高、分布最广的多不饱和脂肪酸，其代谢途径在免疫反应和哮喘等炎症疾病中起关键作用[33]。紫苏子、葶苈子等多种降气化痰药均是花生 四烯酸的成分来源。此外，花生四烯酸及其衍生介质抑制参与哮喘发病机制的几种炎症细胞（如嗜酸性粒细胞）的趋化性和功能，并在体外对气道上皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞具有抗重塑作用，同时诱导粒细胞凋亡、抑制增殖，并帮助启动组织修复和愈合[34-36]。熊果酸是一种存在于多种植物中的天然三萜化合物，来源于多种散结化痰药（如白附子、莱菔子、昆布）、清热解毒药（夏枯草、连翘、金银花）以及活血散瘀药（如鸡血藤、石见穿、水蛭）。研究表明，熊果酸能够下调CCND1 表达抑制 异常的细胞周期和增殖[37]，也可能通过抑制Toll 样 受体4（Toll-likereceptor4，TLR4）/髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路减少炎症介 质的产生和释放，减轻气道炎症来间接影响气道重塑，并减缓哮喘气道重塑的进程[38-40] 。综上，水飞蓟素、花生四烯酸以及熊果酸均能从一定程度上改善哮喘患者的气道炎症及气道重塑。![]()
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哮喘异质性受到多种因素的影响，包括年龄、性别、吸烟与否、环境因素及社会经济地位等。在此， 本研究对年龄、性别、吸烟在哮喘发病中的影响地位进行了评估。结果发现，年龄和性别对重症哮喘EA和NA表型均有较好的预测价值。 但烟草的使用同样是哮喘发病的独立危险因素，并且吸烟对哮喘的控制水平、治疗效果及预后均有不良影响[41]。哮喘发病年龄通常用于区分不同的 成人哮喘临床表型，12 岁常被界定为早发性成人哮喘和迟发性成人哮喘的分水岭。早发性成人哮喘更可能是特应性的，且哮喘发作的频率更高，而患有迟发性成人哮喘的更可能是女性、吸烟者，其相对应的气流阻塞水平也更高[42]。年龄方面，据统计，与男性相比，女性哮喘的发病率更高，尤其是青春期后女性比男性更容易患哮喘且病情更严重[43]，且哮喘发作的概率随着女性基线年龄的增加而降低，而男性则没有明显相关性[44]。同时，
年龄和性别也 关系着哮喘的炎症表型。实验证明，嗜酸性粒细胞浸润的程度随豚鼠的年龄和性别而变化，成年动物（雄性和雌性）中嗜酸性粒细胞的比例较高[45]。但在老年人的肺中没有注意到嗜酸性粒细胞的增加，主要是中性粒细胞的积累[46]。综上，探索和关注年 龄、性别、吸烟在哮喘异质性中的作用，针对这些因素指导哮喘患者个体化治疗和预防有一定助益。本研究通过对重症哮喘患者的气道嗜酸粒细胞炎症表型、中性粒细胞浸润的炎症表型支气管活检样本的转录组数据进行二次深入分析，以明确失巢凋亡在不同炎症表型发病机制的关键靶基因及其干预重症哮喘的通路机制，并探索潜在生物标志物在重症哮喘患者EA、NA 表型中的区分诊断价值 及其在肺内细胞表达情况。最后回归临床，预测具有调控潜在生物标志物作用的关键中药化合物成 分，借助化合物的药动学及毒理学特性、化合物与潜在生物标志物的结合亲和力表征评价干预药物的潜力。同时，通过构建预测模型探索了年龄、性别、吸烟与否对于重症EA、NA 发病与否结局指标 的关系。以期为未来重症哮喘不同炎症表型患者的个体化治疗提供基于生物信息学的靶点依据及新药设计思路。利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
来 源：王 婷，叶 贝，蔡贝贝，饶 玲，张妙芬，黄慧婷，詹少锋，江 勇 ，黄秀芳，刘 琼．失巢凋亡调控重症哮喘患者不同炎症表型的气道重塑机制及其潜在靶向 中药化合物的预测 [J]. 中草药, 2025, 56(1): 203-215.![]()
