基于Wnt/β-catenin信号通路的白头翁皂苷D对结肠癌上皮间质转化的影响

学术 2025-01-30 10:38 天津

结肠癌是全球发病率第3高的恶性肿瘤，约90%结肠癌患者死于肿瘤侵袭和转移^[1]。据报道，超过20%的结肠癌患者会发生肝转移^[2]，这极大地降低了患者生存率。结肠癌转移的病理机制非常复杂，其涉及遗传异常、肿瘤细胞的异质性、肿瘤微环境和肿瘤上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）等因素^[3]。

EMT是细胞的一种生理、病理现象，是具有极性的上皮细胞转化成具有活动能力、能够在细胞基质自由移动的间质细胞的过程。EMT是上皮细胞来源的恶性肿瘤发生侵袭转移的初始过程，在肿瘤侵袭、血型扩散和化疗耐药中均有重要作用^[4-5]。无翅型MMTV整合位点家族（wingless type MMTV integration site family，Wnt）信号通路是调节生长发育的关键通路之一，其与肿瘤发生发展也密切相关^[6]。Wnt信号通路分为经典Wnt通路，即Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路和非经典Wnt通路，其中经典Wnt/β-catenin信号通路的异常激活可以促进肿瘤EMT^[7]。在正常情况下，Wnt/β-catenin信号通路被抑制，Wnt配体的缺失导致重组轴抑制蛋白（recombinant axis inhibition protein，Axin）/糖原合成激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）/腺瘤性结肠息肉病蛋白（adenomatous polyposis coli protein，APC）/酪氨酸蛋白激酶1α蛋白（casein kinase 1 alpha，CK1α）复合物将细胞浆内的β-catenin蛋白磷酸化而降解，同时T细胞因子（T-cell factor，TCF）/‌淋巴增强因子（lymphoid enhancer-binding factor，LEF）与共抑制因子结合而抑制靶基因表达。当Wnt/β-catenin信号通路被激活时，Wnt配体与卷曲蛋白（frizzled，FZD）/低密度脂蛋白受体相关蛋白（low density lipoprotein-related protein，LRP）结合。随后，LRP受体被CK1α和GSK-3β磷酸化，引发Axin/GSK-3β/APC蛋白质复合物解体，从而导致细胞浆内的β-catenin不被降解而转入细胞核内。β-catenin、LEF和TCF蛋白形成转录复合物，启动下游原癌基因（myelocytomatosis viral oncogene homolog，c-Myc）、波形蛋白（Vimentin）和蜗牛蛋白（Snail）等转录，促进肿瘤的发生、发展、EMT和转移^[8]。

研究表明，许多中药成分，如熊果酸^[9]、小檗碱^[10]和姜黄素^[11]等均有良好的抗癌作用。白头翁皂苷D来源于毛茛科植物白头翁Pulsatilla chinensis (Bge.) Regel的干燥根，其具有较强的抗肿瘤作用^[12]，但白头翁皂苷D抗结肠癌的机制尚未明晰。本研究明确了白头翁皂苷D对结肠癌的影响，并基于Wnt/β-catenin信号通路研究其作用机制，为白头翁防治结肠癌提供实验依据。

1 材料

1.1 细胞株

人结肠癌LoVo细胞由中国科学院上海细胞库提供。

1.2 药品与试剂

白头翁皂苷D（质量分数＞98.6%，批号247596）、Wnt/β-catenin信号通路抑制剂IWR-1（批号280452）、Wnt/β-catenin信号通路激动剂SKL2001（批号431237）购自美国MedChemExpress生物科技公司；5-氟尿嘧啶（fluorouracil，5-Fu，批号WXBC7976V）购自美国Sigma公司；Ham’s F-12K培养液（批号BC20230422）购自南京生航生物技术有限公司；胎牛血清（批号C8010-500mL）购自上海泰坦科技股份有限公司；细胞外基质（extracellular matrix，ECM）胶（批号E1270-5ML）购自德国Merck公司。胰蛋白酶细胞消化液（批号C0203）、MTT细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒（批号C0009S）、BCA蛋白检测试剂盒（批号040224240531）、BeyoRT^TM Ⅲ cDNA第一链合成试剂盒（批号120622230413）、RNAeasy^TM动物RNA抽提试剂盒（批号Z928240930）均购自上海碧云天生物科技有限公司。海马无翅基因3a（recombinant wingless type MMTV integration site family member 3a，Wnt3a，批号00140305）、β-catenin（批号00051813）、TCF4（批号00111097）、c-Myc（批号00138557）、GSK-3β（批号00075495）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）（批号00081113）、Vimentin（批号00066574）、Snail（批号00139047）、甘油醛3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH，批号10029187）抗体均购自武汉三鹰生物技术有限公司；青链霉素混合液（批号G4003-100ML）、2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix（批号MPC2407073）和SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒（批号CR2403010）均购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.3 仪器

3001型多功能酶标仪、Forma 3111型CO₂培养箱（美国‌Thermo Fisher Scientific公司）；SW-CT-2FD型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；MF53-N型倒置荧光显微镜（广州市明美光电技术有限公司）；1000 Touch Thermal Cycler型CFX96触屏实时荧光定量PCR检测系统、170-8070型ChemiDoc XRS^＋系统化学发光凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 细胞培养

用Ham’s F-12K培养液（含有10%胎牛血清和1%青链霉素混合液）于37 ℃、5% CO₂的条件下培养人结肠癌LoVo细胞。每2天更换１次培养液，待细胞长满85%以上时，用胰蛋白酶消化传代。

2.2 细胞增殖实验

取对数生长期LoVo细胞，按5×10³个/孔密度接种于96孔板，孵育24 h后，用浓度0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00和32.00 μmol/L的白头翁皂苷D继续孵育细胞48 h。更换含MTT溶液的培养液继续孵育4 h，然后加入100 μL DMSO，避光振摇15 min后，于570 nm波长下检测吸光度（A）值，计算细胞存活率及半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC₅₀）。

细胞存活率＝(A_给药－A_空白)/(A_对照－A_空白)

2.3 细胞划痕实验

取对数生长期LoVo细胞，按2×10⁴个/孔密度接种于24孔板，将细胞分为对照组和白头翁皂苷D低、中、高剂量（7.5、15.0、30.0 μmol/L）组及5-Fu（20 μmol/L）组，待细胞长至80%，用10 μL吸头在细胞单层上做十字划痕，除对照组外，其余各组加入相应浓度含药培养液孵育细胞24 h，在不同时间点（0、12、24 h）于显微镜下观察，计算细胞迁移率。

细胞迁移率＝(0 h划痕面积－不同时间点划痕面积)/0 h划痕面积

2.4 细胞侵袭实验

取冻存于−20 ℃的ECM胶，于4 ℃过夜。将ECM胶用培养液1∶1稀释后，迅速添加至24孔板的Transwell上室（50 μL/孔），并置于37 ℃细胞培养箱内凝固1 h。消化收集处于对数生长期的LoVo细胞，用无血清培养液调整细胞密度至1×10⁶个/mL。细胞分组同“2.3”项下方法，在Transwell上室中分别加入细胞悬液（1×10⁵个/孔），在Transwell下室中，除对照组外，分别加入相应浓度含药培养液，孵育24 h后，用棉签小心地檫除上室中的细胞和ECM胶，用4%多聚甲醛固定Transwell下室的细胞10 min，再用0.1%结晶紫染色细胞15 min，于倒置显微镜下观察，并用Image-J软件分析。

2.5 锚定非依赖性克隆形成实验

将1%琼脂糖凝固于6孔板（1 mL/孔）中，随后将LoVo细胞按5×10⁴个/孔密度接种于琼脂糖，细胞分组同“2.3”项下方法，各组培养液处理细胞14 d，于光学显微镜下观测细胞克隆形成情况。

2.6 qRT-PCR检测mRNA相对表达

取对数生长期LoVo细胞按5×10⁵个/孔密度接种于6孔板，培养24 h后，细胞分组同“2.3”项下方法，分别用各培养液处理细胞48 h，用RNAeasy^TM动物RNA试剂盒抽提细胞总RNA，并用BeyoRT^TM III cDNA第一链合成试剂盒逆转录得到cDNA，随后用2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix在CFX96 T触屏实时荧光定量PCR检测系统上进行扩增。qRT-PCR反应程序为95 ℃预变性30 s、95 ℃变性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，40个循环。以β-actin为内参，采用2^−ΔΔCt法计算样本mRNA相对水平。引物序列见表1。

2.7 Western blotting法检测相关蛋白表达

取对数生长期LoVo细胞按5×10⁵个/孔密度接种于6孔板，培养24 h后，用含白头翁皂苷D（7.5、15.0和30.0 μmol/L）或5-Fu（20 μmol/L）的培养液处理细胞48 h。用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取细胞总蛋白，并用BCA法测定蛋白浓度，蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，在室温下用5%脱脂奶粉封闭45 min后，加入一抗Wnt3a（1∶1 000）、β-catenin（1∶1 000）、TCF4（1∶1 000）、c-Myc（1∶1 000）、GSK-3β（1∶1 000）、E-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、Snail（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000），于4 ℃轻摇孵育过夜。次日，二抗（1∶2 000）室温轻摇孵育90 min，用TBST洗膜3次。用ECL化学发光试剂在ChemiDoc XRS＋System凝胶成像系统显影蛋白条带，以GAPDH为内参，用Image-J软件分析蛋白表达量。

2.8 白头翁皂苷D抗结肠癌作用机制的验证

取对数生长期LoVo细胞，将细胞分对照组、白头翁皂苷D组（15 μmol/L）、IWR-1组（10 μmol/L）、SKL2001组（20 μmol/L）、白头翁皂苷D＋IWR-1组（10 μmol/L）、白头翁皂苷D（15 μmol/L）＋SKL2001组（20 μmol/L），分别按“2.3”“2.6”“2.7”项下方法验证白头翁皂苷D抗LoVo细胞的作用机制。

2.9 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析和绘图。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），两组间比较采用t检验。结果以表示。

3 结果

3.1 对LoVo细胞增殖的影响

用不同浓度的白头翁皂苷D处理LoVo细胞48 h后，LoVo细胞的增殖活性降低。白头翁皂苷D对LoVo细胞IC₅₀为12.90 μmol/L。结果表明，白头翁皂苷D对LoVo细胞增殖活性具有较好的抑制作用，且呈现浓度相关性。在后续药理实验中，将白头翁皂苷D浓度设置为7.5、15.0、30.0 μmol/L。

3.2 对LoVo细胞迁移的影响

如图1所示，与对照组比较，白头翁皂苷D各剂量组和5-Fu组LoVo细胞迁移率显著降低（P＜0.05、0.01），表明白头翁皂苷D能够抑制LoVo细胞迁移，且该作用呈现剂量相关性。

3.3 对LoVo细胞侵袭的影响

如图2所示，与对照组比较，白头翁皂苷D各剂量组和5-Fu组LoVo细胞侵袭数量显著减少（P＜0.05、0.01），提示白头翁皂苷D能够抑制LoVo细胞侵袭，且该作用呈现剂量相关性。

3.4 对LoVo细胞克隆形成的影响

如图3所示，药物处理LoVo细胞14 d后，与对照组比较，白头翁皂苷D各剂量组和5-Fu组细胞克隆数量显著减少（P＜0.05、0.01），表明白头翁皂苷D能够抑制LoVo细胞克隆形成，且该作用呈现剂量相关性，提示白头翁皂苷D可抑制LoVo细胞的恶性转化。

3.5 对LoVo细胞EMT相关基因表达的影响

如图4所示，与对照组比较，白头翁皂苷D各剂量和5-Fu显著升高LoVo细胞E-cadherin的mRNA水平（P＜0.01），降低Vimentin和Snail的mRNA水平（P＜0.01），且呈剂量相关性。与对照组比较，白头翁皂苷D和5-Fu显著增加LoVo细胞E-cadherin的蛋白表达（P＜0.05、0.01），降低Vimentin和Snail的蛋白表达（P＜0.05、0.01），且呈剂量相关性。结果表明，白头翁皂苷D能够抑制LoVo细胞EMT。

3.6 对结肠癌细胞Wnt/β-catenin信号通路活性的影响

如图5所示，与对照组比较，白头翁皂苷D和5-Fu显著降低LoVo细胞Wnt3a、β-catenin、TCF4和c-Myc的mRNA水平（P＜0.01），升高GSK-3β的mRNA水平（P＜0.05、0.01），且呈剂量相关性。与对照组比较，白头翁皂苷D和5-Fu显著降低LoVo细胞Wnt3a、β-catenin、TCF4和c-Myc的蛋白表达（P＜0.05、0.01），增加GSK-3β的蛋白表达（P＜0.05、0.01），且呈剂量相关性。以上结果表明，白头翁皂苷D可抑制结肠癌细胞Wnt/β-catenin信号通路。

3.7 Wnt/β-catenin信号激动剂、抑制剂对白头翁皂苷D药理作用的验证

如图6-A所示，药物处理12 h和24 h后，与对照组比较，白头翁皂苷D（15 μmol/L）显著抑制LoVo细胞迁移，且该作用可被Wnt/β-catenin信号通路抑制剂IWR-1（10 μmol/L）协同增强，也被Wnt/β-catenin信号通路激动剂SKL2001（20 μmol/L）拮抗减弱（P＜0.05、0.01）。如图6-B所示，与对照组比较，白头翁皂苷D（15 μmol/L）显著升高LoVo细胞E-cadherin的mRNA水平（P＜0.05），降低Vimentin的mRNA水平（P＜0.05），且该作用可被Wnt/β-catenin信号通路抑制剂IWR-1（10 μmol/L）协同增强，也被Wnt/β-catenin信号通路激动剂SKL2001（20 μmol/L）拮抗减弱（P＜0.05、0.01）。如图6-C所示，与对照组比较，白头翁皂苷D（15 μmol/L）显著升高LoVo细胞E-cadherin的蛋白表达（P＜0.01），但降低Vimentin的蛋白表达，且该作用可被Wnt/β-catenin信号通路抑制剂IWR-1（10 μmol/L）协同增强，也被Wnt/β-catenin信号通路激动剂SKL2001（20 μmol/L）拮抗减弱（P＜0.05、0.01）。

4 讨论

白头翁的主要活性成分白头翁皂苷D对甲状腺癌^[13]、肺癌^[14]、食管癌^[15]和乳腺癌^[16]等具有良好的抗癌作用。本研究结果表明，白头翁皂苷D能够抑制LoVo细胞增殖，这与白头翁皂苷D通过调控AKT/mTOR信号通路、抑制结肠癌细胞增殖并诱导细胞凋亡的报道一致^[17]。

原发性肿瘤的侵袭转移是肿瘤恶化导致患者死亡的重要原因^[18]。EMT是肿瘤细胞失去上皮细胞特性并获得间质细胞特征的过程，其导致肿瘤细胞从原发部位脱离并获得运动能力^[19]。在EMT过程中，E-cadherin水平降低，间充质状态相关标志物（Vimentin、N-cadherin等）表达升高^[19]。E-cadherin作为上皮细胞的标志之一，其缺失能破坏细胞间的连接并导致肿瘤细胞彼此分离，最终引发间充质细胞状态和转移表型^[20]。Vimentin是一种中间丝蛋白，可支撑间充质细胞的细胞器，通过改变细胞形状与运动促进EMT^[21]。Snail是EMT主要调控因子之一，可通过抑制E-cadherin表达而促进EMT。因此，抑制Vimentin和Snail表达是抗肿瘤EMT的重要策略^[22]。LoVo细胞来源于转移性结肠癌病灶，具有高侵袭性与迁移能力，研究结果发现，白头翁皂苷D能够抑制LoVo细胞侵袭、迁移和恶性转化，促进LoVo细胞E-cadherin的表达，并降低Vimentin和Snail的表达，提示白头翁皂苷D能够抑制LoVo细胞EMT。Wnt/β-catenin信号通路的异常激活可促进肿瘤发生发展、转移扩散以及对化疗耐药^[23]。Wnt3a作为经典的Wnt配体，在结肠癌组织中高表达，上调Wnt3a可促进结肠癌增殖和转移^[24]。β-catenin是经典Wnt/β-catenin通路的核心因子，β-catenin异常高表达是结肠癌的重要病理因素，蓄积的β-catenin可导致Wnt/β-catenin信号通路活性增强，从而激活下游癌基因的转录^[25]。TCF4也是结肠癌发生发展的重要促进因子，其上调可以诱导结肠癌增殖和侵袭^[26]。β-catenin/TCF4相互作用是Wnt信号通路中的“分子开关”，可促进肿瘤的转移与复发^[27]。而c-Myc作为β-catenin/TCF转录复合物的直接靶基因之一，可正向调节多个关键的细胞周期蛋白，促进肿瘤增殖^[28]。GSK-3β是Wnt/β-catenin信号通路中的一种激酶，可磷酸化β-catenin，引发后者的泛素化和蛋白酶降解，从而下调Wnt/β-catenin信号通路活性^[29]。本研究发现，白头翁皂苷D显著降低结肠癌细胞Wnt3a、β-catenin、TCF4和c-Myc的mRNA和蛋白水平，并增强GSK-3β的mRNA和蛋白表达。这与白头翁皂苷D通过调控Wnt/β-catenin通路抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖的结果相似^[30]，提示白头翁皂苷D可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路活性来发挥抗结肠癌作用。

EMT与Wnt/β-catenin信号通路的活性呈正相关，Wnt/β-catenin信号通路的激活可以促进EMT相关因子表达而引发EMT。此外，Wnt/β-catenin信号通路还通过影响肿瘤细胞干性而促进EMT^[25]。本研究发现，白头翁皂苷D可以降低结肠癌细胞Wnt/β-catenin信号通路活性，同时抑制结肠癌的EMT。E-cadherin与Vimentin作为EMT标志基因同时也是Wnt通路的关键靶标^[31]。结果表明，白头翁皂苷D与Wnt/β-catenin信号通路抑制剂IWR-1联用，E-cadherin mRNA与蛋白表达水平进一步升高，Vimentin mRNA与蛋白表达水平进一步降低，与Wnt/β-catenin信号通路激动剂SKL2001联用则相反，表明白头翁皂苷D抗结肠癌 EMT的作用可被IWR-1协同增强，也被SKL2001拮抗减弱。以上结果表明，白头翁皂苷D可抑制结肠癌的EMT，其机制在于抑制Wnt/β-catenin信号通路。

综上，白头翁皂苷D能够显著抑制人结肠癌细胞增殖、侵袭、迁移和恶性转化，调节结肠癌的EMT相关基因表达，抑制结肠癌的Wnt/β-catenin信号通路。但是，本文仅在体外实验方面对相关机制进行了研究。今后，将进一步开展体内动物实验，更加深入地揭示白头翁皂苷D抗结肠癌 EMT的分子机制，为临床上使用白头翁防治结肠癌转移提供的科学依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来源：彭宇辉，王敏敏，雷家荣，唐晓梦，何紫雨，刘晓虹，明天琪，李煜兵，冉宇鑫，郑凯杰，徐海波．基于Wnt/β-catenin信号通路的白头翁皂苷D对结肠癌上皮间质转化的影响 [J]. 中草药, 2024, 56(2): 499-508.

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