马来酰亚胺修饰的柠檬苦素纳米粒的制备、表征及其口服药动学研究

学术 2025-01-31 09:07 天津

柠檬苦素（limonin）是一种含呋喃环的三萜类成分，在楝科（Meliaceae）、芸香科（Rutaceae）等药用植物均可提取得到^[1-2]。药理学研究显示柠檬苦素具有抗肿瘤、镇痛、抗焦虑、抗氧化、改善睡眠、保护神经等活性^[2-4]，具备一定的开发价值和临床使用价值。柠檬苦素溶解度仅为（6.12±0.08）µg/mL^[5]，溶出度较低，且体内受P糖蛋白外排作用和首关效应的影响^[6]，严重影响了其口服吸收，柠檬苦素在大鼠体内生物利用度仅5.43%^[7]，导致其药理活性无法充分发挥。目前柠檬苦素新型制剂研究报道的有磷脂复合物^[8]、脂质体^[9]等，但磷脂复合物黏性较大，制备时一般需采用毒性较大的四氢呋喃等有机试剂^[10-11]，成药性较差；脂质体处方中辅料种类较多，口服后胃肠道中的各种消化酶容易破坏脂质体结构^[12]，从而影响了其生物利用度提高幅度。

纳米技术在医药领域展现出巨大优势，可极大地改善药物溶解度及溶出度，降低不良反应，为促进药物吸收、增强药效等奠定基础。其中，生物黏附性纳米粒（bioadhesive nanoparticles）是纳米制剂研究热点之一^[13-14]，该给药系统系采用生物黏附性材料作为纳米载体，利用载体的黏附性延长纳米药物在吸收部位的滞留时间，从而增加药物吸收量，提高生物利用度。壳聚糖常被作为生物黏附性材料，但壳聚糖的酸膨胀性和碱难溶性容易影响纳米结构的稳定性^[13]。胃肠道黏液层中含有大量的黏蛋白，而黏蛋白含大量游离巯基，马来酰亚胺基团可选择性地与黏蛋白表面的巯基进行共价结合^[15-16]，从而赋予其生物黏附性。

本研究采用含有马来酰亚胺基团的马来酰亚胺-聚乙二醇-聚乳酸［maleimide-methoxy poly (ethylene glycol)-poly(lactic acid)，Mal-PEG-PLA］作为载体，制备马来酰亚胺修饰的柠檬苦素纳米粒（maleimide-modified limonin nanoparticles，Mal-Lim-NPs），并进行溶解度、透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）、体外释药行为等研究。采用聚乙二醇-聚乳酸［poly(ethylene glycol)-poly (lactic acid)，PEG-PLA］为载体，制备非生物黏附性纳米粒，即柠檬苦素纳米粒（limonin nanoparticles，Lim-NPs），比较Mal-Lim-NPs和Lim-NPs口服药动学行为和相对口服生物利用度，期望为柠檬苦素及其他难溶性中药活性成分的开发提供研究思路。

1 仪器与试药

1.1 仪器

SQP型电子天平，赛多利斯科学仪器北京有限公司；1290 Infinity II/G6470B型高效液相-质谱联用仪、1200型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；KQ-300GTDV型超声仪，昆山市超声仪器有限公司；L6S型紫外分光光度仪，上海仪电分析仪器有限公司；TG16G型台式高速离心机，上海川纳实验仪器有限公司；85-2B型恒温磁力搅拌器，常州迈科诺仪器有限公司；Zetasizer Nono ZS-90型粒度测定仪，英国马尔文公司；JEM-2100型透射电子显微镜（TEM），日本电子株式会社；DW-86L348型超低温冰箱，澳柯玛股份有限公司；MF600型X射线粉末衍射仪，日本理学Rigaku公司；RC-16MD型溶出仪，天津市精拓仪器科技有限公司；YTLG-10A型真空冷冻干燥机，上海叶拓科技有限公司；DN200-24A型氮气吹扫仪，上海左乐仪器有限公司。

1.2 材料

Mal-PEG₂₀₀₀-PLA₂₀₀₀（批号Y22P01S05）、PEG₂₀₀₀-PLA₂₀₀₀（批号Y23P9JSN1），上海炎怡生物科技有限公司；柠檬苦素对照品，批号20201002，质量分数98.6%，西安开来生物科技有限公司；柠檬苦素原料药，批号202008，质量分数97.0%，湖北东康源科技有限公司；多潘立酮对照品，批号S-024-230206，质量分数99.2%，成都瑞芬思生物科技有限公司；磷酸，批号C12747030，上海麦克林生化科技有限公司；十二烷基硫酸钠（SDS），批号20191120，山东澳凯化工有限公司；磷酸二氢钾，批号20201015，国药集团化学试剂有限公司；甘露醇，批号20220715，湖南九典制药股份有限公司。

2 方法与结果

2.1 Mal-Lim-NPs的制备

薄膜-超声法制备Mal-Lim-NPs。取柠檬苦素10 mg和处方量Mal-PEG-PLA置于圆底烧瓶中，加入10 mL丙酮后置于40 ℃水浴中，600 r/min转速下磁力搅拌至溶解澄清。于旋转蒸发仪上缓慢除去有机溶剂（水浴温度为40 ℃），在圆底烧瓶内壁留下一层柠檬苦素与Mal-PEG-PLA形成的均匀透明薄膜，置于40 ℃真空干燥箱中过夜，以除尽残留溶剂。将圆底烧瓶置于40 ℃水浴中，加入40 ℃的纯化水适量，600 r/min转速下磁力搅拌30 min使之充分水化，于一定功率下超声一定时间（频率为40 kHz），迅速置于−10 ℃冰箱中固化10 min，采用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得Mal-Lim-NPs。同法制备空白纳米粒（不加柠檬苦素）。

2.2 柠檬苦素定量测定

2.2.1 色谱条件色谱柱为Dikma-C₁₈（150 mm×4.6 mm，5 μm）柱；体积流量1.0 mL/min；柱温为30 ℃；流动相为甲醇-水（60∶40）；进样体积10 μL；检测波长220 nm。理论塔板数以柠檬苦素计不低于5 000。

2.2.2 线性关系考察精密称10.48 mg柠檬苦素对照品至50 mL量瓶中，加甲醇约40 mL超声溶解，继续加甲醇稀释定容，即得柠檬苦素对照品储备液（质量浓度为209.60 μg/mL）。采用甲醇稀释配制5 240.0、2 620.0、1 310.0、524.0、104.8、52.4 ng/mL系列柠檬苦素对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定不同质量浓度（X）柠檬苦素对照品溶液的峰面积（Y），得线性回归方程：Y＝32.054 X－6.981，r＝0.999 8，线性相关系数r接近1，结果表明柠檬苦素在52.4～5 240.0 ng/mL存在良好的线性关系。

2.2.3 Mal-Lim-NPs供试品溶液的制备精密吸取1 mL Mal-Lim-NPs至10 mL量瓶中，加入5 mL甲醇-丙酮混合溶剂（4∶1），超声5 min破乳，放置至室温后加入甲醇-丙酮混合溶剂（4∶1）稀释定容，摇匀后精密吸取1 mL置于10 mL量瓶中，流动相稀释定容，即得Mal-Lim-NPs供试品溶液。取空白纳米粒1 mL，同法制备空白纳米粒溶液。

2.2.4 专属性考察取空白纳米粒溶液、Mal-Lim-NPs供试品溶液和柠檬苦素对照品溶液，分别按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，色谱图见图1，结果表明柠檬苦素色谱峰未受辅料等杂质干扰，专属性高。

2.2.5 精密度考察取质量浓度为5 240.0 μg/mL（高）、1 310.0 μg/mL（中）、52.4 μg/mL（低）柠檬苦素对照品溶液和Mal-Lim-NPs供试品溶液，分别按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，各测定6次，计算得柠檬苦素高、中、低质量浓度对照品溶液和Mal-Lim-NPs供试品溶液峰面积的RSD分别为0.20%、0.28%、0.24%、0.69%，表明该仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性考察取Mal-Lim-NPs供试品溶液，分别于制备后0、3、6、9、18、24 h，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，计算得柠檬苦素峰面积的RSD为0.93%，结果表明Mal-Lim-NPs供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.7 重复性考察取Mal-Lim-NPs样品，按“2.2.3”项下方法制备6份Mal-Lim-NPs供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，计算柠檬苦素质量分数的RSD为1.76%，结果表明该方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率考察取0.5 mL Mal-Lim-NPs样品至10 mL量瓶中，共9份，分为高、中、低3组，每组3份。分别精密加入柠檬苦素对照品储备液（质量浓度209.60 μg/mL）0.4、0.7、1.0 mL，按“2.2.3”项下方法制备Mal-Lim-NPs供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定柠檬苦素总量，计算其加样回收率和RSD值。结果显示，柠檬苦素的平均加样回收率为100.19%，RSD为1.64%，结果表明该方法准确度较高。

2.3 包封率、载药量、粒径及ζ电位的测定

精密吸取1 mL Mal-Lim-NPs样品，置于超滤管（截留相对分子质量10 000）中，12 000 r/min离心（离心半径为8.6 cm）10 min，取外管滤液，按“2.2.1”项下色谱条件测定游离药物量（m_游离）。精密吸取1 mL Mal-Lim-NPs样品，按“2.2.3”项下方法操作，测定总药物量（m_总）。精密吸取1 mL Mal-Lim-NPs样品置−55 ℃冰箱中预冻3 d，置于冷冻干燥机（冷阱温度−30 ℃，真空度为5.0 Pa）中，2 d后取出，取出称定质量（m₀）。计算Mal-Lim-NPs中柠檬苦素的包封率和载药量。

包封率＝(m_总－m_游离)/m_总

载药量＝(m_总－m_游离)/m₀

取100 μL Mal-Lim-NPs置于离心管中，加5 mL纯化水震荡混匀。取适量稀释后的Mal-Lim-NPs置于比色皿中，测定Mal-Lim-NPs的粒径（仪器参数：折射率为1.47，遮光度为5%，吸收率为0.01%），平均粒径以强度径表示。另取适量稀释后的Mal-Lim-NPs至电槽中，测定ζ电位。每份样品平行测试3次，取平均值。

2.4 单因素实验考察Mal-Lim-NPs处方工艺

2.4.1 Mal-PEG-PLA与柠檬苦素用量比考察固定柠檬苦素用量为10 mg，水相体积为30 mL，超声功率为200 W，超声时间为10 min等条件不变，考察载体材料Mal-PEG-PLA与柠檬苦素用量比对Mal-Lim-NPs包封率、载药量和粒径的影响，结果见表1。随着Mal-PEG-PLA用量增加，Mal-Lim-NPs包封率先增加后趋稳；载药量先增大后下降，表明增加Mal-PEG-PLA用量有利于增加包封率，但用量过大时使得Mal-Lim-NPs载药量下降；Mal-Lim-NPs粒径随着Mal-PEG-PLA用量增加而增大，可能是因为载体材料用量较大时体系黏度升高，导致纳米粒子之间相互碰撞、融合等^[17]，进而使粒径增大。Mal-PEG-PLA与柠檬苦素用量比为3∶1时Mal-Lim-NPs包封率过低，而用量比为20∶1时载药量过低，期望Mal-PEG-PLA同时具有较高的包封率和载药量，故后续对两者用量比5∶1～15∶1进行优化。

2.4.2 水相体积考察固定柠檬苦素用量为10 mg，Mal-PEG-PLA与柠檬苦素用量比为10∶1，超声功率为200 W，超声时间为10 min等条件不变，考察水相体积对Mal-Lim-NPs包封率、载药量和粒径的影响，结果见表2。Mal-Lim-NPs的包封率和载药量均随着水相体积的增加呈先增大后下降趋势，可能是水相体积过小影响载体材料Mal-PEG-PLA水化的速度和程度，进而影响Mal-Lim-NPs载药^[18]；水相体积过大时，Mal-Lim-NPs更大程度地暴露在水相环境中，因而药物泄露几率也越大^[19]。Mal-Lim-NPs粒径随着水相体积增加总体呈减小趋势，可见水相体积对Mal-Lim-NPs包封率、载药量和粒径均有影响，后续对水相体积20～40 mL进行优化。

2.4.3 超声功率考察固定柠檬苦素用量为10 mg，Mal-PEG-PLA与柠檬苦素用量比为10∶1，水相体积30 mL，超声时间为10 min等条件不变，考察超声功率对Mal-Lim-NPs包封率、载药量和粒径的影响，结果见表3。随着超声功率的增大，Mal-Lim-NPs包封率和载药量均呈先增大后下降趋势，可能是适当的超声功率有利于载体材料Mal-PEG-PLA在水相中充分舒展并载药^[20]，但超声功率过大时可能影响Mal-Lim-NPs结构的稳定性，导致药物泄露^[18]。Mal-Lim-NPs粒径随着超声功率增大而变小，可能是超声功率越大提供的能量越大，体系温度升高同时黏度下降，有利于Mal-Lim-NPs粒径变小。超声功率为200 W时Mal-Lim-NPs包封率和载药量均较高，粒径小于200 nm，故采用超声功率为200 W制备Mal-Lim-NPs。

2.4.4 超声时间考察固定柠檬苦素用量为10 mg，Mal-PEG-PLA与柠檬苦素用量比为10∶1，水相体积30 mL，超声功率为200 W等条件不变，考察超声时间对Mal-Lim-NPs包封率、载药量和粒径的影响，结果见表4。随着超声时间的延长，Mal-Lim-NPs包封率和载药量均呈先增大后下降趋势，说明合适的超声时间有利于增加Mal-PEG-PLA水化程度，促使载体材料包载药物^[18]；超声时间过长时包封率和载药量均出现下降情况，可能是超声时间过长时体系温度急剧升高，影响了Mal-PEG-PLA材料的稳定性，进而可能对Mal-Lim-NPs结构产生了影响，导致药物泄露。超声时间过长时Mal-Lim-NPs粒径也出现增长趋势，可见超声时间对Mal-Lim-NPs影响较大，后续对超声时间10～20 min继续优化。

2.5 Box-Behnken设计-效应面法（Box-Behnken design-response surface method，BBD-RSM）优化Mal-Lim-NPs处方工艺

2.5.1 试验设计单因素考察时发现，Mal-PEG-PLA与柠檬苦素用量比、水相体积和超声时间是影响Mal-Lim-NPs包封率、载药量和粒径的主要因素，分别作为自变量X₁、X₂、X₃，筛选区间及水平见表5。将Mal-Lim-NPs的包封率、载药量和粒径分别作为因变量Y₁、Y₂、Y₃，为了同时兼顾3个指标，将包封率、载药量和粒径进行归一化处理，采用总评归一值（overall desirability，OD）进行总体评价。

OD具体计算过程为采用公式d_max＝(M_i－M_min)/(M_max－M_min)分别计算d_包封率和d_载药量，采用公式d_min＝(M_max－M_i)/(M_max－M_min)计算d_粒径，式中M_max、M_min和M_i分别为最大值、最小值和实际值；OD＝(d_包封率d_载药量d_粒径)^1/3。

Mal-Lim-NPs不同处方工艺试验组合的Y₁、Y₂、Y₃和OD见表5。

2.5.2 数学模型的建立、方差分析与最佳处方工艺确定使用Design Expert V10.0.3软件对OD数据进行拟合，得拟合方程为OD＝0.680－0.120 X₁－0.061 X₂－0.190 X₃－0.034 X₁X₂＋0.150 X₁X₃－0.097 X₂X₃－0.240 X₁²－0.200 X₂²－0.180 X₃²。方差分析结果见表6，表明建立的OD数学模型具有极显著性差异（P＜0.000 1），方程的R²和R_adj²分别为0.987 7和0.971 9；失拟项P值为0.094 4＞0.05，无统计学意义，说明干扰因素对结果影响可忽略。拟合方程中X₁、X₂、X₃、X₁X₃、X₂X₃、X₁²、X₂²和X₃²有极显著性差异（P＜0.01）。

响应面三维图见图2，表明随着其中2因素的增大OD均呈先上升后下降趋势。设置OD为望大值，区间为0～0.8，得Mal-Lim-NPs最佳处方工艺：Mal-PEG-PLA与柠檬苦素用量比为7.53∶1，水相体积为34.82 mL，超声时间为13.16 min，OD预测值为0.802。

2.6 Mal-Lim-NPs工艺验证

为便于操作，将Mal-Lim-NPs处方略作调整（调整幅度小于2%）：Mal-PEG-PLA与柠檬苦素用量比为7.5∶1，水相体积为35 mL，超声时间为13 min。平行制备3批Mal-Lim-NPs（批号分别为20231227、20240111、20240118），测定其平均包封率、载药量和粒径，计算OD及其相对偏差［相对偏差＝(实际值－预测值)/预测值］。结果显示，3批Mal-Lim-NPs的平均包封率、载药量、粒径和OD分别为（81.63±1.30）%、（9.32±0.24）%、（171.56±6.63）nm和0.795±0.060（n＝3），其中OD与预测值（0.802）较为接近，相对偏差为−0.87%，表明建立的数学模型预测性能良好。

另测得Mal-Lim-NPs的多分散指数（polydispersity index，PDI）为0.101±0.009（n＝3），ζ电位为（−16.60±0.92）mV（n＝3）。

2.7 Mal-Lim-NPs冻干粉的制备及及表征

2.7.1 Mal-Lim-NPs冻干粉的制备采用纯化水配制甘露醇质量分数为15%的溶液，精密量取10 mL，加入20 mL Mal-Lim-NPs，混匀后分装至西林瓶中，液面高度1.5 cm左右。−55 ℃超低温冰箱中预冻3 d，立即置于冷冻干燥机（冷阱温度−30 ℃，真空度为5.0 Pa）中，2 d后取出，即得Mal-Lim-NPs冻干粉。同法制备Mal-Lim-NPs直接冻干粉（不加甘露醇）。

取柠檬苦素原料药分散于纯化水，即得混悬液，Mal-Lim-NPs样品、Mal-Lim-NPs冻干粉和Mal-Lim-NPs冻干粉纯化水复溶后的外观见图3，由于柠檬苦素较强的疏水性及较低的水溶性，导致形成的混悬液均匀性极差，而制备成Mal-Lim-NPs后均匀性良好，可见蓝色乳光。Mal-Lim-NPs冻干粉复溶后，测得其平均包封率、粒径和ζ电位分别为（80.45±0.96）%、（178.87±7.04）nm和（−16.20±1.31）mV。

Mal-Lim-NPs和冻干粉复溶后粒径分布见图4-A，冻干粉复溶后平均粒径略有增大；Mal-Lim-NPs冻干粉复溶后ζ电位绝对值略有降低，ζ电位见图4-B。

2.7.2 TEM观察取Mal-Lim-NPs，采用纯化水稀释30倍，滴3滴至铜网上，轻微震荡使之铺展，加1.0%磷钨酸钠，置35 ℃真空干燥箱中30 min，于TEM下观察Mal-Lim-NPs外貌（测试参数：点分辨率0.23 nm，加速电压200 kV，线分辨率0.14 nm），用纯化水代替Mal-Lim-NPs，作为空白对照样品。

Mal-Lim-NPs直接冻干粉（不加甘露醇）和Mal-Lim-NPs冻干粉，加入纯化水复溶后同法观察Mal-Lim-NPs外貌，结果见图5。空白对照样品未观察到任何纳米粒形态（图5-A），说明图5-B～D观察到的均是Mal-Lim-NPs。Mal-Lim-NPs外貌近似球形（图5-B），将Mal-Lim-NPs的直接冻干粉复溶后纳米粒子破坏严重，塌陷现象明显（图5-C），而Mal-Lim-NPs冻干粉（含甘露醇）加纯化水复溶后未观察到纳米粒被破坏的现象（图5-D），说明添加冻干保护剂甘露醇制备Mal-Lim-NPs冻干粉是必要的。

2.8 晶型研究

XRPD测试条件：角度（2q）为3°～45°，Cu-Kα靶，扫描速率为4°/min。取柠檬苦素原料药、空白辅料（甘露醇与Mal-PEG-PLA简单混合，比例同Mal-Lim-NPs冻干粉）、物理混合物（药物与辅料比例同Mal-Lim-NPs冻干粉，仅简单混合）、Mal-Lim-NPs直接冻干粉（不加甘露醇）和Mal-Lim-NPs冻干粉适量，置于X射线粉末衍射仪下测试，结果见图6。柠檬苦素原料药在11.7°、12.0°、12.9°、13.9°、16.2°、18.7°、19.6°和20.4°处出现特征晶型峰，其中以11.7°、12.0°和12.9°等处较强。物理混合物样品中仍可观察到柠檬苦素部分特征晶型峰，说明柠檬苦素晶型未改变。Mal-Lim-NPs直接冻干后可观察到柠檬苦素特征晶型峰，但峰强度明显下降。Mal-Lim-NPs冻干粉XRPD图谱仅可观察到空白辅料晶型衍射峰，说明柠檬苦素在Mal-Lim-NPs冻干粉中晶型可能发生了改变。

2.9 溶解度测定

取过量柠檬苦素原料药和Mal-Lim-NPs冻干粉分别置于pH 2.0磷酸盐缓冲液（PBS）中，超声15 min后，置于25 ℃恒温震荡器震荡48 h（转速为100 r/min），8 000 r/min离心（离心半径8.6 cm）10 min，取上清液测定柠檬苦素的溶解度。同法测定各样品在pH 5.0、6.8 PBS中的溶解度，结果见表7。Mal-Lim-NPs冻干粉在pH 2.0、5.0、6.8 PBS中，柠檬苦素的溶解度分别提高至其原料药的33.71、78.21、41.16倍。

2.10 体外释药情况比较

取柠檬苦素原料药和Mal-Lim-NPs冻干粉适量，使柠檬苦素含量为5 mg，加入pH 2.0 PBS（含1% SDS）8 mL震荡混匀后转移至透析袋（截留相对分子质量为10 000）中，扎紧。采用《中国药典》2020年版四部通则0931第二法浆法，取pH 2.0 PBS（含1% SDS）900 mL作为介质，介质温度为（37±1）℃，转速为75 r/min，取样点为0、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、4.00、6.00、12.00、18.00 h，取样体积和补加空白介质均为5 mL。8 500 r/min离心（离心半径为8.6 cm）15 min，测定柠檬苦素含量。同法考察在pH 5.0、6.8 PBS（含1.0% SDS）中的释药情况，结果见图7。柠檬苦素原料药在pH 2.0、5.0、6.8 PBS中18 h累积释放率分别为30.50%、23.97%、28.66%。Mal-Lim-NPs在pH 2.0、5.0、6.8 PBS中18 h累积释放率分别提高至71.86%、65.66%、68.71%。分别采用一级释放、Higuchi、Weibull模型对Mal-Lim-NPs冻干粉的体外释放曲线进行拟合，拟合结果见表8。Mal-Lim-NPs在pH 2.0、5.0、6.8 PBS中的释药过程均与Weibull模型拟合度最高，说明Mal-Lim-NPs释药过程分为快速、缓慢释药2个阶段，符合双相动力学特征^[20]。

2.11 Mal-Lim-NPs冻干粉沉降率测定及其稳定性考察

取新制备的Mal-Lim-NPs冻干粉，加入纯化水复溶，测定柠檬苦素含量（M₀）。取储存不同时间的Mal-Lim-NPs冻干粉样品，加入纯化水复溶，过0.45 μm微孔滤膜，测定柠檬苦素的量（M₁），计算Mal-Lim-NPs冻干粉的沉降率。

沉降率＝(M₀－M₁)/M₀

取密封后的Mal-Lim-NPs冻干粉置于温度30℃、湿度65%恒温恒湿箱中，分别于0、15、30、60、90 d取样，分别测定沉降率、包封率、粒径、不同介质（pH 2.0、5.0、6.8 PBS）中的溶解度和XRPD，结果见表9和图8。Mal-Lim-NPs冻干粉在加速条件下储存90 d后沉降率小于2.0%，包封率仍大于80%，粒径仍小于200 nm，在不同pH值介质中溶解度无明显变化。XRPD图谱（图8）显示，各时间点的Mal-Lim-NPs冻干粉中未观察到柠檬苦素原料药在11.7°、12.0°和12.9°等处特征晶型峰，表明Mal-Lim-NPs冻干粉稳定性良好。

2.12 Lim-NPs及其冻干粉的制备

参考Mal-Lim-NPs最佳处方工艺，采用PEG-PLA替换Mal-PEG-PLA，同法制备Lim-NPs。测得Lim-NPs的平均包封率、载药量、粒径和ζ电位分别为（78.16±1.17）%、（8.84±0.19）%、（157.74±6.63）nm、（−22.06±1.42）mV。按“2.7.1”项下操作制备Lim-NPs冻干粉，测得复溶后平均包封率、粒径和ζ电位分别为（76.90±0.90）%、（163.48±5.79）nm和（−20.31±1.26）mV。

2.13 口服药动学考察

2.13.1 试验方案取柠檬苦素原料药、Lim-NPs冻干粉和Mal-Lim-NPs冻干粉适量，加入0.5% CMC-Na水溶液制备ig液。取18只禁食12 h的SD大鼠，随机分为3组，按照50 mg/kg（以柠檬苦素计）剂量ig，于0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h在大鼠眼眶后静脉丛取血约250 μL，置于抗凝剂（1.5%肝素钠溶液）浸润离心管中，震荡混匀后3 000 r/min离心（离心半径8.6 cm）3 min，取淡黄色血浆冷冻保存。

2.13.2 内标溶液的配制和血浆样品处理过程^[8] 采用甲醇配制多潘立酮质量浓度为800 ng/mL（内标溶液），取25 μL加至50 μL血浆样品中，再加入200 μL甲醇，涡旋混匀后加入1.5 mL醋酸乙酯，涡旋5 min充分提取多潘立酮和柠檬苦素。6 000 r/min离心10 min沉淀蛋白，取上层有机相至离心管中，37 ℃氮气缓慢吹除有机溶剂，加入50 μL甲醇复溶，即得含内标物质的血浆样品溶液。

2.13.3 血药浓度分析方法色谱柱为Hypersil C₁₈（100 mm×2.1 mm，1.8 µm）柱；流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液（1∶1）；体积流量为0.3 mL/min；测试时间5 min；柱温为30 ℃；进样体积为5 µL。采用正离子模式，电喷雾离子源（ESI），多级反应监测（multiple reaction monitoring，MRM），雾化气体积流量1.5 L/min，脱溶剂管温度和热模块温度分别为250 ℃和200 ℃，监测电压为1.7 kV。定量分析时柠檬苦素和多潘立酮定量离子对分别为m/z 471.2→161.1和m/z426.3→175.2。

2.13.4 柠檬苦素血浆对照品溶液的配制及线性关系考察取柠檬苦素对照品溶液（800 ng/mL）采用甲醇稀释至400、200、100、10、5 ng/mL，分别取50 μL置于离心管中，37 ℃氮气缓慢吹除有机溶剂。分别加入空白血浆50 μL，按“2.13.2”项下方法操作制备血浆对照品溶液，按“2.13.3”项下分析条件进样测定。以柠檬苦素质量浓度（C）对柠檬苦素与多潘立酮峰面积比（A_i/A_s）进行线性回归，得回归方程C＝532.7 A_i/A_s－12.49，r＝0.996 2，结果表明柠檬苦素血浆对照品溶液在5～800 ng/mL线性关系良好。

2.13.5 专属性考察取空白血浆、血浆对照品溶液（5 ng/mL）和血浆样品溶液，分别按“2.13.3”项下分析条件进样测定，结果见图9，柠檬苦素保留时间为3.38 min，内标物质多潘立酮保留时间为3.06 min，分离度和专属性均较高。

2.13.6 精密度考察取质量浓度为5、400、800 ng/mL柠檬苦素血浆对照品溶液，按“2.13.3”项下分析条件连续测试6次，计算得柠檬苦素与多潘立酮峰面积比（A_i/A_s）的RSD分别为8.43%、4.06%和3.24%，结果表明该仪器精密度良好。

2.13.7 稳定性考察取血浆样品溶液，分别于制备后0、3、6、12、18、24 h，按“2.13.3”项下分析条件进样测定，计算得A_i/A_s的RSD为5.60%，结果表明血浆样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.13.8 重复性考察取柠檬苦素原料药ig 2 h的血浆样品，按“2.13.2”项下方法操作，制备6份供试品溶液，按“2.13.3”项下分析条件进样，测定柠檬苦素与多潘立酮峰面积，计算得柠檬苦素质量浓度的RSD为4.18%，结果表明该实验重复性良好。

2.13.9 基质效应与提取回收率考察制备柠檬苦素质量浓度为800、200、5 ng/mL的质控样品（均含内标），按“2.13.2”项下方法处理，按“2.13.3”项下分析条件进样测定峰面积（A₁），各质量浓度均为3个样本。取50 μL空白血浆，按“2.13.2”项下方法处理（不加内标）得残渣，分别加入800、200、5 ng/mL的柠檬苦素对照品溶液和多潘立酮内标溶液，各质量浓度均为3个样本，按“2.13.3”项下分析条件测定峰面积（A₂），计算提取回收率。结果显示，柠檬苦素和多潘立酮的平均提取回收率分别为94.78%（RSD为5.52%，n＝9）和97.01%（RSD为6.10%，n＝9）。取800、200、5 ng/mL柠檬苦素溶液（均含内标），各质量浓度均为3个样本，进样测定峰面积（A₃），计算基质效应。结果显示柠檬苦素及内标的基质效应分别为93.74%（RSD为4.08%，n＝9）和97.23%（RSD为7.24%，n＝9）。表明柠檬苦素和多潘立酮的提取回收率高，同时基质效应小，可用于测定血药浓度。

提取回收率＝A₁/A₂

基质效应＝A₂/A₃

2.13.10 药动学结果比较绘制柠檬苦素原料药、Lim-NPs和Mal-Lim-NPs药-时曲线，结果见图10。用DAS 2.0软件非房室模型对数据进行分析，结果见表10。与柠檬苦素原料药相比，Lim-NPs的药动学参数均有显著性改变（P＜0.05、0.01），其中达峰时间（t_max）显著性延后，末端消除半衰期（t_1/2）显著性延长，药峰浓度（C_max）和药-时曲线下面积（AUC₀_～_t和AUC₀_～_¥）分别增加至3.69、3.24、3.32倍。Mal-Lim-NPs的药动学参数具有极显著性改变（P＜0.01），其中t_max极显著性延后，t_1/2极显著性延长，C_max、AUC₀_～_t、AUC₀_～_¥分别提高至柠檬苦素原料药的4.01、5.65、5.89倍。与Lim-NPs相比，Mal-Lim-NPs的t_1/2进一步延长，AUC₀_～_t或AUC₀_～_¥进一步增加，表明Mal-Lim-NPs能进一步增加柠檬苦素体内吸收。

3 讨论

薄膜-超声法操作简便，无溶剂残留问题，故采用薄膜-超声法制备Mal-Lim-NPs。通过BBD-RSM筛选出Mal-Lim-NPs最佳处方工艺，测得平均包封率为（81.63±1.30）%，符合《中国药典》2020年版四部9014项下微粒制剂对包封率的要求（不得低于80%）。柠檬苦素具有一定的脂溶性，在与载体材料Mal-PEG-PLA形成脂质薄膜时，柠檬苦素易与Mal-PEG-PLA亲脂性的PLA基团融合在一起，在水化作用下进而发生链间纠缠、缔合形成结构稳定的Mal-Lim-NPs^[20]。

在测定饱和溶解度时，分别考察了Mal-Lim-NPs样品震荡24、36、48、60 h溶解度变化情况，发现震荡48 h后溶解度基本不再变化，为节约时间故确定震荡48 h。考察发现柠檬苦素在物理混合物（药物与辅料比例同Mal-Lim-NPs冻干粉）中的溶解度也具有极显著性提高。这是由于Mal-PEG-PLA属于两亲性聚合物，在水相中通过自组装形成纳米胶束，从而对药物起到了增溶作用^[18,20]。Mal-Lim-NPs冻干粉XRPD研究结果显示，柠檬苦素在Mal-Lim-NPs冻干粉中可能以无定型形式存在，有利于药物溶解度和累积释放率的改善，并促进药物体内吸收^[21-22]。Mal-Lim-NPs在pH 2.0、5.0、6.8 PBS均具有双相动力学特征，快速释药有利于柠檬苦素体内快速吸收，缓慢释药有利于维持血药浓度，从而改变了口服药动学行为^[21]。

Mal-Lim-NPs包封率略高于Lim-NPs，可能是由于Mal-Lim-NPs表面修饰马来酰亚胺基团形成了一层保护层，阻止了Mal-Lim-NPs表层或浅表层药物泄露^[22]，从而使Mal-Lim-NPs包封率略高于Lim-NPs。Mal-Lim-NPs的ζ电位绝对值不足20 mV，会影响其储存稳定性，故将Mal-Lim-NPs制备成冻干粉。将Mal-Lim-NPs直接冻干成冻干粉时，Mal-Lim-NPs微观外貌有塌陷、破坏等现象，而加入冻干保护剂甘露醇后，Mal-Lim-NPs微观外貌保持良好，可能是由于甘露醇分子中含多个羟基，易与Mal-Lim-NPs表面基团之间形成氢键^[23]，从而在冻干脱水过程中发挥保护作用，有利于维持纳米粒子微观外貌。

口服给药是患者最易于接受的给药途径，顺应性高，且经济安全，故本研究对Mal-Lim-NPs口服药动学进行了考察。据报道^[24]，柠檬苦素ig剂量为200 mg/kg时基本无毒性反应，本研究采用柠檬苦素ig剂量为50 mg/kg，因此，采用该剂量进行药动学研究具有一定的安全性。

Mal-Lim-NPs的t_max发生显著性延后可能与双相动力学过程中的缓释阶段有关，另外Mal-Lim-NPs表面修饰马来酰亚胺基团可与胃肠道黏液层黏蛋白上的巯基进行共价结合，进而延长了Mal-Lim-NPs胃肠道滞留时间^[25]，最终导致t_max显著性延后，同时也对其药动学参数t_1/2产生了较大影响，Mal-PEG-PLA结构中还含有PEG长链基团，当Mal-Lim-NPs以整体形式进入血液循环后可赋予长循环特点^[20]，从而导致t_1/2延长，利于药物在肠道充分吸收。Mal-Lim-NPs进一步增加了AUC₀_～t，可能是Mal-PEG-PLA对包裹的药物起到保护作用，降低了胃肠道消化酶、pH值等因素对柠檬苦素的破坏几率^[26]；Mal-Lim-NPs增加了柠檬苦素在不同pH值介质中的溶解度和释放度，改善了吸收瓶颈；Mal-PEG-PLA中PEG长链可抑制P-糖蛋白介导的外排作用^[22,27]，增加药物体内吸收。

Mal-Lim-NPs促吸收作用大于Lim-NPs，这可能是由于Mal-Lim-NPs是一种黏附性纳米粒，降低药物在粪便中直接排泄几率^[27-28]，延长了t_1/2，从而使药物被充分吸收^[29]；Mal-Lim-NPs的肠道黏附性可提高药物局部浓度，促进被动扩散，因而最终进一步增加了吸收，证明对纳米粒表面进行马来酰亚胺基团修饰是必要的。

综上，本研究采用单因素结合响应面优化筛选出Mal-Lim-NPs最佳处方工艺，包封率大于80%，符合《中国药典》2020年版对微粒制剂的要求，体外释药呈双相动力学特征，口服后AUC₀_～t增加至5.65倍，显著增加了药物吸收量，本研究为后续Mal-Lim-NPs中试研究、药效学评价等奠定了研究基础。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来源：陈永顺，杨斌．马来酰亚胺修饰的柠檬苦素纳米粒的制备、表征及其口服药动学研究 [J]. 中草药, 2024, 56(2): 487-498.

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