基于“肠-关节”轴探究肠道菌群与类风湿关节炎的因果关系及潜在干预中药预测

学术 2025-01-20 08:31 天津

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种常见的全身炎症性自身免疫病，主要症状为关节疼痛、肿胀、僵硬及功能丧失，以滑膜增生、炎性细胞浸润及骨破坏为主要病理特征，严重损害患者生活质量，是我国肢体致残的主要原因之一^[1-3]。RA的全球平均患病率为0.5%～1.0%^[4]，据估计中国约有500万人患病^[5]。其致病因素不明，发病机制复杂，疾病晚期预后较差，因此如何达标治疗一直是国内外研究的热点问题。目前临床上主要使用抗风湿药进行治疗，但仍存在治疗不完善的情况^[6]。肠道菌群作为能够直接影响机体免疫反应的因素之一，其在RA领域中的作用逐渐被挖掘^[7]，有研究表明罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri等益生菌可以改善RA症状，可成为治疗的新靶点和新手段，“肠-关节”轴为重要的潜在机制^[8-10]。

孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）是一种利用全基因组关联研究数据（genome-wide association study，GWAS）、单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）作为工具变量（instrumental variable，IV）来评估暴露因素与疾病之间因果关系的方法^[11-12]，与传统观察性研究相比，可以更好地控制混杂因素，增加研究结果稳健性^[13-14]。已有研究发现生活环境、饮食习惯等因素与RA发病间存在因果关系，某些肠道菌可能与RA之间存在因果关系，但由于纳入病例较少，存在较高的偏倚，仍然缺乏探究GM与RA之间的联系的MR分析^[15-16]。

本研究旨在通过孟德尔随机化方法探讨肠道菌群与类风湿关节炎之间的关系，并预测能通过“肠-关节”轴起到治疗作用的中药及其有效成分，以期为临床提供新的治疗思路与药物选择。

1 资料与方法

1.1 研究设计

本研究采取孟德尔随机化分析方法，对肠道菌群与类风湿关节炎的因果关系进行研究。选择肠道菌群作为暴露因素，与肠道菌群相关的SNPs作为IV，RA作为结果变量。满足MR三大假设^[13]：①IV与暴露因素（肠道菌群）密切相关；②IV与混杂因素无关；③SNPs不直接影响结局，仅通过肠道菌群影响结局。采用Cochran’s Q检验评估异质性，MR-Egger检验水平多效性，“留一法”敏感性分析验证结果的稳定性。获得SNPs相邻基因，进行功能、通路富集分析，并检索基因相关中药，对其基本信息及有效成分进行统计分析。研究流程见图1。

1.2 数据来源

本研究通过NHGRI-EBI GWAS 数据库（https://www.ebi.ac.uk/gwas/）获取肠道菌群的GWAS；通过IEU GWAS数据库（https://gwas.mrcieu. ac.uk/terms/）获取RA的GWAS。肠道微生物的遗传数据（ID：GCST90027446-GCST90027857）来源于Lopera-Maya等^[17]发表于2022年的1项研究，涉及7 738例参与者，通过宏基因组测序与16S粪便微生物测序，得到207个肠道微生物分类群（5门、10纲、13目、26科、48属和105种）及205条遗传分析途径。RA的GWAS数据（ID：ebi-a-GCST90018910）来源于Sakaue等^[18]发表于2021年的1项研究，包含417 256个样本以及24 175 266个SNPs。所有数据均来源于欧洲，暴露人群与结局人群不存在人种差异。原始GWAS研究已得到相应机构伦理委员会批准，本研究未使用个体水平数据，不需要新的伦理委员会批准。

1.3 工具变量选择

为严格控制数据质量，选择恰当的IVs，以确保满足相关性假设，使结论具有准确性与真实性。首先，筛选出与肠道菌群显著相关的SNPs，阈值设定为P＜1×10⁻^5[19]，删去存在回文结构的SNPs，参数设置为kb＝10 000，r²＝0.001，去除连锁不平衡的SNPs^[20]，避免IV间的连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）的影响，并记录相应的效应等位基因（effect allele，EA）、非效应等位基因（other allele，OA）、β值、标准误差（standard error，SE）值及P值，计算F统计值评估IV与暴露因素的相关性，F＜10的SNP被认为相关性较差为弱工具变量，需予以剔除^[21]。

1.4 MR分析

将筛选后得到的SNPs作为IV，进行MR分析。逆方差加权法（inverse variance weighted，IVW）假设所有SNP都是有效的IVs，通过比较所有SNP的个体变异比率估计的加权平均值，综合评估暴露因素与疾病之间的关联性^[22]，具有最准确的效应估计值^[23]，因此主要使用IVW来分析肠道菌群与RA之间的相关性。同时还使用了MR Egger回归法、加权中位数法（weighted median estimator，WME）、简单模式法、加权众数法作为补充方法^[24]。MR Egger回归法多用于检测和调整多效性^[25]。WME法能够在大于50%的IVs无效的情况下，提供正确的因果关系^[26]。简单模式法和加权众数法作为MR分析中的2种分析方式，补充分析以提高结果可靠性。因此使用IVW作为主要分析方法，当IVW的P＜0.05时，认为因果关系显著，与其他4种方法获得的P值方向相同时，考虑具有相对稳定的因果关系^[27]。

1.5 敏感性分析

MR Egger截距试验用于确定是否存在水平多效性^[28]，以截距值＜0.05、P＞0.05代表数据不存在水平多效性。Cochran’s Q用于检验异质性^[29]，P＞0.05代表数据不存在异质性。“留一法”用于评估结果是否具有稳健性，确定每个SNP是否影响结局^[30]。

1.6 工具变量邻近基因功能富集分析

基于特定SNP的位置即其所在的染色体序列和位点，来识别与之相邻的相关基因^[31]。为进一步探究邻近基因的潜在功能，对邻近基因进行基因本体论（gene ontology，GO）分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析，筛选出具有显著富集意义（adjust P＜0.05）的GO和KEGG条目。GO分析分为分子功能（molecular function，MF）、生物过程（biological process，BP）、细胞成分（cellular component，CC）3类，用于注释基因功能；KEGG用于识别基因富集的途径。通过微生信平台（http:// www.bioinformatics.com.cn/）对GO和KEGG结果进行可视化处理。

1.7 潜在干预中药预测与分析

将得到的邻近基因提交到Coremine数据库（https://coremine.com/medical/），检索调控邻近基因的中药，P＜0.05为筛选标准。根据《中国药典》《中药大辞典》《中华本草》《中药学》统计纳入中药的四气五味及归经^[32]。通过TCMSP数据库（https:// www.tcmsp-e.com/#/home）检索中药的活性成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug-likeness，DL）≥18%筛选活性成分；HERB数据库（http://herb.ac.cn/）进行补充，SwissADME数据库（http://www.swissadme.ch/）中检索有效成分，筛选条件为同时满足GI absorption为“high”，类药性（lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）“Yes”结果至少多与2个。通过Cytoscape（https://cytoscape.org/）构建“基因-中药-活性成分”网络图。

1.8 统计学分析

本研究使用R4.2.3进行统计学分析，使用“TwoSampleMR”“ieugwasr”“gwasglue”等R包进行MR分析，使用“vautils”“dplyr”包提取工具变量的邻近基因。

2 结果

2.1 肠道菌群与RA的因果效应

将412个不同的肠道微生物群（207个分类群和205个通路）纳入研究后，严格筛选IV，选择RA相应的SNPs，且IV的F检验值＞10，以消除弱工具变量，最终筛选出25个SNPs，具体数据见表1。

以IVW法为主要分析方法，结果显示多尔氏菌属Dorea（GCST90027711，OR＝0.852，95% CI：0.744～0.975，P＝0.020）；副血链球菌Streptococcus parasanguinis（OR＝0.918，95% CI：0.847～0.995，P＝0.037）；韦荣球菌属Veillonella_unclassified（OR＝0.926，95% CI：0.869～0.987，P＝0.018）与RA发病呈负相关；毛螺菌科（Lachnospiraceae）细菌5_1_63FAA（OR＝1.070，95% CI：1.006～1.138，P＝0.031）是RA发病的危险因素。具体数据见表2，结果见图2。

2.2 敏感性分析

ME-Egger回归法与Cochran’s Q异质性检验结果表明，MR分析结果不存在水平多效性和异质性（P＞0.05），具体数据见表3。“留一法”逐一剔除SNP后，分析结果未发生变化，表明研究结果具有稳健性，具体数据见图3。

2.3 工具变量邻近基因的GO、KEGG功能富集分析

对SNP邻近基因进行功能和通路富集分析。GO分析结果见图4-A，BP主要涉及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）激活的凋亡信号通路（TRAIL-activated apoptotic signaling pathway）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）诱导激酶活性的激活（activation of NF-κB-inducing kinase activity extrinsic apoptotic signaling pathway）以及通过死亡结构域受体的外源性凋亡信号通路（negative regulation of extrinsic apoptotic signaling pathway via death domain receptors）等；CC主要涉及细胞投影的肌动蛋白基础簇（cluster of actin-based cell projections）等；MF主要涉及细胞内配体门控离子通道活性（intracellular ligand-gated ion channel activity）等。KEGG分析结果见图4-B，主要富集到病毒蛋白与细胞因子及细胞因子受体的相互作用（viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor）、钙信号通路（calcium signaling pathway）及自然杀伤细胞介导的细胞毒性（natural killer cell mediated cytotoxicity）等。

2.4 潜在中药预测分析

使用Coremine Medical数据库，对SNP邻近基因相关中药进行筛选，共得到95味中药（P＜0.05），其中出现频次较高的药物有升麻、白花蛇舌草、苍耳子、高良姜等。对95味中药进行四气五味、归经及功效统计分析，结果显示，预测中药的四气以寒为主，温、平次之；五味以苦为主，甘、辛次之；归经以肝经为主，肺经、脾经次之；功效以清热药为主，补虚药、活血化瘀药次之，如图5-A～D所示。通过TCMSP数据库和HERB数据库，对基因进行有效成分检索，得到898种有效成分，其中出现频次较高的代表成分为β-谷甾醇（β-sitosterol）、槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、豆甾醇（stigmasterol）等，使用Cytoscape软件构建“基因-中药-有效成分”网络，如图6所示。

3 讨论

RA是最常见的自身免疫性炎性关节炎，其复杂的免疫机制尚不明确^[33]。有多项研究表明，肠道菌群在宿主免疫系统的启动、维持和运行中起着关键作用，菌群及其代谢产物失调在RA的发生及发展中发挥作用^[34-35]。肠道菌群与RA的关系已成为近10年的热门研究课题，肠道菌群在RA的预防和治疗中发挥作用的具体机制仍然是目前医学界积极钻研的课题^[36-39]。目前，此类研究报道相对有限，迫切需要进行更高质量的研究以探求明确两者之间存在的关联，故本研究采用MR分析评估肠道菌群与RA之间的因果关系，对相关邻近基因进行功能及通路富集，并使用公共数据库找到通过“肠-关节”轴靶向治疗的中药及其有效成分。研究发现，多尔氏菌属、副血链球菌及韦荣氏球菌属Veillonella_unclassified与RA的患病风险存在负向因果关系；毛螺菌科细菌5_1_63FAA与RA的患病风险存在正向因果关系。

多尔氏菌属属于厚壁菌门毛螺菌科^[40]，可以通过调节肠道屏障功能和炎症反应参与宿主免疫反应的调节，有研究^[41-44]指出多尔氏菌属与饮食相关，在溃疡性结肠炎、2型糖尿病及肾结石等多种疾病中丰度存在显著变化，多尔氏菌属参与肠道中多种代谢过程，如发酵碳水化合物及产生短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）等^[45]。SCFAs是调节肠道健康的关节代谢物，在维持骨稳态、减少调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）接收促炎信号及抑制破骨细胞活性等方面发挥重要作用^[46]。多尔氏菌属可能通过调节SCFAs改善RA症状，但其与RA的关系还需要基础实验进行进一步验证。副血链球菌是一种兼性厌氧球杆菌状细菌，属于人类口腔微生物群的一部分，并能穿过肠道屏障在黏膜表面定植^[47]。该菌表达大量黏附素，通过竞争性排斥机制，有助于防止潜在病原体的入侵，从而对人体起到保护作用^[48]。动物研究显示，副溶血链球菌Streptococcusparasanguinis通过促进Treg细胞、抑制Th细胞的基因表达，在肠道免疫中发挥抗炎和益生作用^[49]。此外，副溶血链球菌对各种病原体具有抑制活性，能够抑制铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa、伴放线放线杆菌Aggregatibacter actinomycetemcomitans等机会性病原体^[50]，但其与RA相关的潜在机制仍不清楚。韦荣球菌属Veillonella_unclassified是韦荣球菌属中的一个分类单元，而韦荣球菌属具有促进Th1免疫应答、调节Th2免疫应答的特性^[51]，因此其可能通过调节肠道免疫功能，降低RA的发病风险。毛螺菌科细菌5_1_63FAA是一种属于毛螺菌科的细菌，有研究发现毛螺菌科可能通过发挥促炎作用增加肉芽肿性多血管炎的发病风险^[52]，毛螺菌科细菌5_1_63FAA可能通过炎症反应通路增加RA的发病风险。肠道菌群的多样性及可塑性，使其在医疗领域尤其是在个性化治疗方面有着巨大的应用潜力^[53]。中药有效成分在体内与肠道菌群相互作用，参与肠肝循环，改善菌群丰度与代谢产物，肠道菌群参与中药的生物转化过程，发挥治疗作用，恢复肠道微生态系统平衡^[54-55]。有多项研究验证，植物药有效成分能够调节本研究筛选出的肠道菌群^[56-59]。尽管从遗传学角度证实了这4个肠道菌群与RA具有因果关系，但仍需进一步探索其在RA中的致病或治疗意义。为了更深入地探究肠道菌群及其代谢物影响RA发病的潜在机制，通过对肠道菌群邻近基因进行GO和KEGG富集分析，发现主要包括细胞信号传导、免疫反应及细胞死亡等方面。主要在病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用抗病毒，钙信号通路，NK细胞介导的细胞毒性，细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路显著富集，从而通过“肠-关节”轴调控RA的发病机制。

中医将RA归为“痹证”“尪痹”等范畴，据《临证医案指南·痹》记载：“痹者，痹而不通之谓也，正气为邪所阻，脏腑经络不能畅达，皆由气血亏损，腠理疏豁，风寒湿三气得以乘虚外袭，留置于内，致湿痰浊血，流注凝涩而得之。”本病属本虚标实，病位以肝、肾、脾为主，其病机特点可概括为邪气侵袭、正气虚弱、痰瘀内阻^[60]。中医药在治疗RA方面积累了丰富经验，中药的多分子、多靶点、多通路的优势在治疗RA中发挥重要作用。本研究对工具变量邻近基因进行中药预测及分析，发现药物功效主要表现为清热解毒、补益虚损、活血化瘀；四气多属寒、温、平；五味多属苦、甘、辛；归经多在肝、肺、脾。从中药功效角度看，清热药缓解症状以白花蛇舌草、牡丹皮、生地黄为代表，补虚药扶护正气以甘草、黄精、补骨脂为代表，活血化瘀药驱邪外出以丹参、姜黄、红花为代表，与“扶正理论”的治疗原则相符合^[61]。从中药性味来看，寒凉药以解毒滋阴、温药助行散；苦味药“能泻、能燥、能坚”以化痰散结、降泻逐瘀，辛味药则“能散、能行、能化”以活血化湿、疏通内外，甘平以补虚和中、调和诸药。总体来看，预测中药能清泄邪实、缓中补虚，与本虚标实的病机特点相吻合，证明本研究得到的中药基本符合中医病机及理法方药。通过频次统计，发现升麻、白花蛇舌草、苍耳子、高良姜等药物在基因预测中出现次数较高，在“肠-关节”轴治疗RA中起到重要作用。升麻中含有异阿魏酸、三萜皂苷、β-谷甾醇等化合物^[62]，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、神经保护和抗骨质疏松等多种药理特性^[63]，可以通过抑制NF-kB抑制蛋白（inhibitory of NF-κB，IκB）/NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/激活蛋白-1（activator protein，AP-1）信号通路、抑制巨噬细胞活化发挥抗炎作用^[64]，下调基质金属蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）、MMP-3及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的水平促进细胞增殖保护软骨细胞^[65]。高良姜中的高良姜素、山柰酚、槲皮素等为主要活性成分，具有抑制胃肠运动、抗炎和镇痛作用^[66-67]，通过抑制NF-κB/环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）信号通路及下游炎症因子水平，起到抗炎作用进而保护胃肠道黏膜^[68]。苍耳子主要活性成分为β-谷甾醇、芦荟大黄素、黄花菜木脂素A、豆甾醇等^[69]，具有较强的抗炎、镇痛作用^[70]，可通过阻断NF-κB活化、抑制氨基末端激酶（jun kinase，JNK）/p38 MAPK磷酸化来抑制炎症反应^[71]，并且能够通过能量代谢、激素代谢、氨基酸代谢和氧化应激反应来治疗RA^[72]。白花蛇舌草主要包含黄酮类、蒽醌类及其他化合物，其中山柰酚和槲皮素及其衍生物是黄酮类的代表化合物^[73]，具有抗菌消炎、抗肿瘤、调节免疫等作用^[74]，能够抑制纤维细胞样滑膜细胞FLS增殖和MMP-9蛋白表达，通过调节MMP-9/miR-204-5p/心肌梗死相关转录本轴影响RA的进展^[75]。

经统计筛选出的潜在干预中药有效成分，发现β-谷甾醇、槲皮素、山柰酚、豆甾醇等成分出现频次较高。这些活性成分不仅是上述4味高频中药中的活性成分，也是多种中药的有效成分，能够作为部分中药的代表化合物，并且在调节肠道菌群方面展具有显著的潜力。其中，β-谷甾醇与豆甾醇均属于植物甾醇类成分。β-谷甾醇以降低血清胆固醇为主要功能，可调节白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平，抑制慢性炎症^[76]。β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、调节骨代谢平衡及调节免疫系统等作用^[77]，能够抑制MAPK信号通路活化从而具有较高的抗炎能力，调节巨噬细胞极化减轻关节症状、抑制VEGF信号通路减少滑膜血管生成^[78-81]。同时，β-谷甾醇可以通过调节肠道菌群组成的多样性，增加乳杆菌科（Lactobacillaceae）等菌种丰度，改善肠道屏障功能及调节Th17/Treg平衡，降低炎症反应^[82]。豆甾醇是一种不饱和甾醇，是植物甾醇生物合成途径的最终产物^[83]，具有抗炎、抗癌和神经保护性等药理作用^[84]，可以降低IL-34/集落刺激因子1受体信号通路和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体水平起到镇痛作用^[85]；通过抑制磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路从而促进FLS的凋亡^[86]；通过降低破骨细胞分化相关因子抗NF-κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL）、抗酒石酸酸性磷酸酶5及组织蛋白酶K水平从而减轻关节症状。植物甾醇类成分能够上调有益菌丰度，增加SCFAs水平，调节免疫反应^[87]，多角度、多靶点治疗RA。槲皮素、山柰酚作为黄酮类化合物，通过靶向细胞信号传导途径，发挥其生物学效应，在抗炎镇痛及免疫调节方面表现出潜在应用价值^[88]。槲皮素能够恢复T细胞稳态，调节Th17/Treg相关细胞因子水平，抑制淋巴细胞腺苷脱氨酶，从而发挥免疫调节作用进而减轻RA炎症反应^[89]；也可以降低半胱氨酸蛋白酶-8（Caspase-8）水平，靶向抑制RA中的铁死亡和焦亡^[90]；通过调节NF-κB信号通路、MAPK信号通路、miR-146a/人GATA结合蛋白6轴及抑制中性粒细胞胞外诱捕网产生等多种机制来减轻RA临床症状^[91]。槲皮素在调节肠道菌群方面，发现能够通过“肠道菌群-SCFAs-炎症”信号通路减少骨丢失及降低炎症反应^[92-93]。山柰酚可能通过特异性抑制RANKL刺激JNK和p38-MAPK的磷酸化，以达到对破骨细胞的抑制作用^[94]；通过阻断MAPK通路、NF-κB/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路，抑制FLS增殖，从而减轻炎症反应^[95-96]，调节胶原诱导性关节炎小鼠的肠道菌群和微生物代谢，使其具有抗关节炎活性^[97]。本研究中预测的中药与有效成分与临床使用的药物存在交集，这不仅间接验证了研究结果的准确性和可靠性，而且凸显了这些中药化合物在“肠-关节”轴上的治疗潜力。鉴于其在RA治疗中的潜在应用价值，可能为探索新的治疗策略和药物开发提供重要的研究方向。

4 结论

综上所述，本研究利用MR分析方法，对肠道菌群与RA的GAWS数据进行分析，发现4种与RA患病风险之间存在显著因果关系的肠道菌群，进行了SNPs相关基因的功能和通路的富集分析，肠道菌群主要通过病毒蛋白与细胞因子受体的相互作用、钙信号通路及NK细胞介导的细胞毒性通路干预RA发病。同时预测能够通过“肠-关节”轴治疗RA的中药，对其进行四气五味及归经分析，并且基于MR分析与网络药理学提取中药有效成分，丰富中医药治疗RA的微观机制，为中医药治疗整体观提供新的治疗思路，对中医药现代化发展起到重要作用。但本研究存在一定局限性：纳入数据库数据均来自欧洲，还需来自其他人种的数据进行研究，减小不同人群之间的差异，使研究结果更具有普适性，为中医药的研究提供有力参考；纳入的数据基数大，可能会存在样本重叠，导致结果出现偏倚；GAWS数据库中未提供纳入人群的基线信息，因此无法对不同人群亚组进行进一步的研究；MR分析与中药预测的结果需要进一步的临床与基础研究进行验证，来证明其在RA治疗上的作用与价值。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来源：王怡文，王思维，卫博文，王文，金玥，刘维．基于“肠-关节”轴探究肠道菌群与类风湿关节炎的因果关系及潜在干预中药预测 [J]. 中草药, 2024, 56(2): 585-597.

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