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基于一测多评定量联合化学计量学及Logistic回归模型的白前质量等级预测

学术   2025-01-30 10:38   天津  



白前Cynanchi Stauntonii Rhizoma et Radix为萝藦科植物柳叶白前Cynanchum stauntonii (Decne.) Schltr. ex Lévl.或芫花叶白前C. glaucescens (Decne.) Hand.-Mazz.的干燥根茎和根，主要分布于湖北、安徽、江西、浙江、广西、四川等省[1-2]，具有降气、消痰、止咳的功效，临床用于肺气壅实、咳嗽痰多、胸满喘急[3-4]。白前主要含有皂苷类、三萜类、甾醇类、黄酮类、木脂素类和挥发油等[5-7]，现代研究发现：白前有镇咳祛痰、抗炎镇痛、抗肿瘤、抗血栓、消化系统作用、抗感染抗病毒等[8-11]作用。白前目前执行《中国药典》2020年版一部标准，该标准仅制定了性状、显微鉴别和理化鉴别项[3]。中药材所含化学成分易受产地环境、气候、种属、采收时间、炮制方法贮藏方式影响，为保证其临床疗效，本研究采集湖北、安徽、浙江、江西、广东、广西、福建、湖南、云南、四川、甘肃和贵州12省36批白前药材，以熊果酸为内参物，采用一测多评（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）法同时测定白前中白薇苷A、白薇苷B、白前苷B、熊果酸、胡萝卜苷、β-谷甾醇含量，同时检测醇溶性浸出物、总灰分和酸不溶性灰分，并采用化学计量学[12]、因子分析（factor analysis，FA）法[13]区分不同产地白前药材，对其质量进行评价，通过Logistic回归法建立模型进行相应的验证[14-15]，旨为不同产地白前的质量评价提供可靠便捷的方法及数据支撑。

1  材料

1.1  试药

对照品熊果酸（批号110742-202424，质量分数99.7%）、β-谷甾醇（批号110851-201909，质量分数92.7%）购于中国食品药品检定研究院；白前苷B（批号PRF9102541，质量分数99.8%）和胡萝卜苷（批号PRF8021422，质量分数99.3%）源于成都普瑞法科技开发有限公司；白薇苷A（批号HY-N3672-597606，质量分数99.6%）源于上海皓元生物医药科技有限公司；白薇苷B（批号T123832-159106，质量分数为98.7%）源于上海陶术生物科技有限公司；白前样品由山西药科职业学院李宝霞副教授按《中国药典》2020年版一部标准鉴定，为萝藦科植物柳叶白前C. stauntonii (Decne.) Schltr. ex Lévl.的干燥根茎和根，其来源信息见表1；高效液相用乙腈和磷酸（美国Roe Scientific INC公司），其他试剂为分析级。

1.2  仪器

Shimadzu LC-20A型、Waters 2695型和Agilent 1260型HPLC仪分别购自日本岛津公司、美国Waters公司和美国Agilent公司；色谱柱Apollo C18、Nucleosil C18和Discovery C18，规格均为（250 mm×4.6 mm，5 μm）；XS105型电子天平、MS205DU型电子天平（瑞士Mettler toledo公司）。

2 方法与结果

2.1  QAMS法多指标成分的测定

2.1.1  混合对照品溶液的制备  准确称取各对照品，用70%甲醇溶解后混匀，制成白薇苷A、白薇苷B、白前苷B、熊果酸、胡萝卜苷、β-谷甾醇质量浓度分别为0.074、0.312、0.370、0.058、0.116、0.230 mg/mL的贮备液；精密吸取贮备液2.5 mL，置50 mL量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.2  供试品溶液的制备  取白前粉末约0.5 g，准确称定于具塞锥形瓶中，准确加70%甲醇25 mL，称定质量，加热回流45 min，冷却，补充质量，摇匀，静置，滤过，即得。

2.1.3  色谱条件  采用Apollo C18色谱柱；检测波长210 nm；流动相0.2%磷酸-乙腈（B），梯度洗脱：0～12 min，42.0% B；12～27 min，42.0%～65.0% B；27～32 min，65.0%～72.0% B；32～43 min，72.0%～90.0% B；43～55 min，90.0%～42.0% B；运行时间55 min；柱温30 ℃，体积流量1.0 mL/min，进样量10 µL。在此条件下，供试品溶液与对照品溶液的HPLC色谱峰出峰顺序和时间一致，各成分的理论板数均高于4 500。色谱图见图1。

2.1.4标准曲线绘制  分别准确量取“2.1.1”项贮备液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置不同的20 mL量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀制成一定质量浓度差的6份溶液。各自动进样10 µL，对采集的白薇苷A、白薇苷B、白前苷B、熊果酸、胡萝卜苷、β-谷甾醇峰面积与相应的质量浓度绘制标准曲线，结果见表2。6个成分在各自范围内线性关系良好。

2.1.5  精密度试验  取样品（S1），按“2.1.2”项方法制成供试品溶液，连续进样6次，10 µL/次，测定峰面积，白薇苷A、白薇苷B、白前苷B、熊果酸、胡萝卜苷、β-谷甾醇峰面积的RSD值分别为1.43%、1.04%、0.96%、1.59%、1.22%和1.18%。

2.1.6  稳定性试验  取白前（S1）供试品溶液1份，于室温放置0、4、8、12、16、20、24 h进样，10 µL/次，测定峰面积，白薇苷A、白薇苷B、白前苷B、熊果酸、胡萝卜苷、β-谷甾醇峰面积的RSD值依次为1.68%、1.38%、1.25%、1.65%、1.59%和1.41%。

2.1.7  重复性试验  取样品（S1）6份，分别按“2.1.2”项方法制成供试品溶液，各进样10 µL，计算白薇苷A、白薇苷B、白前苷B、熊果酸、胡萝卜苷、β-谷甾醇质量分数的RSD值依次为1.74%、1.52%、1.47%、1.82%、1.69%和1.61%。

2.1.8  加样回收率试验  取样品（S1）9份，每份0.25 g，准确称定，根据已测定各成分含量的80%、100%、120%的比例加入混合对照品溶液（含白薇苷A 0.037 mg/mL、白薇苷B 0.212 mg/mL、白前苷B 0.279 mg/mL、熊果酸0.026 mg/mL、胡萝卜苷0.058 mg/mL、β-谷甾醇0.121 mg/mL），再按“2.1.2”项方法制得加标供试品溶液，每个水平制备3份。进样检测，结果白薇苷A、白薇苷B、白前苷B、熊果酸、胡萝卜苷、β-谷甾醇的平均加样回收率分别为98.03%、100.12%、100.06%、97.66%、98.51%和99.04%，RSD分别为1.29%、0.69%、0.74%、1.45%、1.50%和1.51%。

2.1.9相对校正因子（ƒ）计算  精密吸取“2.1.1”项6个混合对照品溶液，10 µL/个，按浓度从低到高的顺序依次注入液相色谱仪，记录6个成分色谱峰峰面积，参照公式（1）计算各成分的ƒ值[16]。

ƒ＝(ρs×Ai)/ρi×As)                   （1）

ρ和A依次代表相质量浓度和峰面积，下标i和s代表内参物和其他待测成分

以熊果酸为内参物，计算白薇苷A、白薇苷B、白前苷B、胡萝卜苷和β-谷甾醇的ƒ值，计算结果见表3。取平均值分别作为各成分定量的ƒ值[17]。

2.1.10  ƒ耐用性考察  分别考察仪器及色谱柱、体积流量、柱温的改变对ƒ的影响。选用HPLC色谱系统（Shimadzu LC-20A型、Waters 2695型和Agilent 1260 型HPLC仪）和色谱柱（Apollo C18柱、Nucleosil C18柱和Discovery C18柱）、体积流量（0.8、1.0、1.2 mL/min）、柱温（25、30、35 ℃），取“2.1.1”项混合对照品溶液，依法检测，结果见表4，ƒ耐用性良好。

2.1.11  色谱峰定位  记录“2.1.10”项采用不同HPLC仪和色谱柱时白薇苷A、白薇苷B、白前苷B、熊果酸、胡萝卜苷、β-谷甾醇的色谱峰保留时间，考察HPLC仪和色谱柱的改变对相对保留时间（ΔtR）的影响，结果见表5，表明用待测成分与内参物的相对保留时间值来定位具有可行性。

2.1.12 含量测定及QAMS法验证  按“2.1.2”项流程将编号S1～S36的白前制成供试品溶液，各进样10 µL，运用外标法（ESM）和QAMS法分别计算36批样品中各成分含量，再运用SPSS 26.0统计软件中独立样本t检验方法验证QAMS法的准确性。结果见表6。结果表明QAMS法与ESM法无差异。

2.1.13  醇溶性浸出物检测  取36批白前样品（S1～S36），参照《中国药典》2020年版四部通则2201浸出物测定法[18]测定醇溶性浸出物。结果见表7。

2.1.14  总灰分和酸不溶性灰分检测  取36批白前样品（S1～S36），参照《中国药典》2020年版四部通则2302灰分测定法测定[18]总灰分和酸不溶性灰分。结果见表7。结果显示36批白前样品中醇溶性浸出物、总灰分和酸不溶性灰分均存在一定的差异，这可能与产地环境、采集时间有关。

2.2  化学计量学评价

2.2.1  主成分分析（principal component analysis，PCA） 运用SPSS 26.0统计软件对36批白前中6 个成分QAMS含量、醇溶性浸出物、总灰分和酸不溶性灰分检测结果进行处理。以1为特征值的阈值，同时满足累积方差贡献率大于85%[19]，提取出2个主成分分析，其中主成分1的特征值为6.385，对方差的贡献率为70.942%，其中白薇苷B、白前苷B、熊果酸、胡萝卜苷、醇溶性浸出物、总灰分和酸不溶性灰分具有较大的载荷值；主成分2的特征值为1.719，对方差的贡献率为19.103%，体现了白薇苷A和β-谷甾醇的信息（表8）。应用SIMCA 14.1软件对36×9矩阵数据进行PCA，模型自动拟合2个主成分，模型拟合度为90.0%。结果36批白前分组明显，其中S1～S11、S12～S24、S25～S36分别聚为一组，产地相近的样品聚为一组，且所有检测数据点均在95%置信区间内（图2），这可能与样品源于不同产地的生长环境、采集时间相关。

2.2.2 建立FA评价体系 按公式（2）对表6和表7中36批白前中9个指标测定数据进行标准化处理，得标准化数据矩阵。

               （2）

Xij为第i批样品第j个成分的含量，为36批白前第j个成分的平均含量，SDj为36批白前第j个成分含量的标准差，Yij为第i批样品第j个成分含量标准化后结果。

再结合表8中成分得分系数值，按公式Fi1＝0.076 Yi1＋0.150 Yi2＋0.150 Yi3＋0.152 Yi4＋0.142 Yi5−0.024Yi6＋0.148 Yi7−0.144 Yi8−0.140Yi9；Fi2＝0.443 Yi1−0.115 Yi2−0.107Yi3＋0.020 Yi4−0.181 Yi5＋0.549 Yi6＋0.033 Yi7−0.080Yi8−0.137 Yi9分别计算36批白前第1、2主成分得分。按公式（3）计算主成分相对权重，结果主成分1和2相对权重分别为0.788和0.212。

Wt＝Ct/Cz                             （3）

Wt为第t个主成分相对权重，Ct为第t个主成分方差贡献率，Cz为累积方差贡献率

再按公式Fi＝0.788 Fi1×＋0.212 Fi2计算白前各批次主成分综合得分[20-21]（表9），并按照主成分综合得分对样品进行排序。结果显示S25的综合得分最高，其质量最优。

2.2.3  正交偏最小二乘判别分析法（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）  为查找导致差异的主要化学标记物，在PCA基础上运行OPLS-DA分析程序，结果模型参数均接近1（R2X＝0.938、R2Y＝0.865、Q2＝0.853），提示建立的模型优秀[22]（图3）。OPLS-DA图显示的分组结果与PCA一致，样品聚类更为集中。分析各变量的变量重要投影性（variable importance in projection，VIP）值（图4），以大于1为显著影响，结果VIP＞1的组分从高到低依次为白前苷B、白薇苷B和β-谷甾醇，表明上述3个成分是导致差异的主要化学标记物。

2.3Logistic回归分析

2.3.1  Logistic回归模型建立  根据主成分分析样品分组以及白前中白薇苷A、白薇苷B、白前苷B、熊果酸、胡萝卜苷、β-谷甾醇、醇溶性浸出物、总灰分和酸不溶性灰分检测结果，将36批白前初步分为优、良、差3个等级，优级样品为S25～S36，良级样品为S1～S11，差级样品为S12～S24。从3个等级样品中随机各抽取6批次样品作为训练集，其余样品作为测试集。将选定的训练集样品中白薇苷A、白薇苷B、白前苷B、熊果酸、胡萝卜苷、β-谷甾醇、醇溶性浸出物、总灰分和酸不溶性灰分检测数据导入SPSS 26.0统计软件中，建立Logistic回归分析模型[14-15, 23]，获得3个等级样品的模型表达式分别为：
P优＝exp(−80.407−180.295C白薇苷A＋64.796 C白薇苷B＋39.670 C白前苷B−20.862C熊果酸−24.905C胡萝卜苷＋22.471 Cβ-谷甾醇＋38.967 C醇溶性浸出物−155.427 C总灰分−4.398 C酸不溶性灰分）/[1＋exp(−80.407−180.295 C白薇苷A＋64.796 C白薇苷B＋39.670 C白前苷B−20.862C熊果酸−24.905C胡萝卜苷＋22.471 Cβ-谷甾醇＋38.967 C醇溶性浸出物−155.427 C总灰分−4.398 C酸不溶性灰分）]
P中＝exp(−349.168−523.798 C白薇苷A＋233.005 C白薇苷B＋247.375 C白前苷B−591.277 C熊果酸−181.273 C胡萝卜苷＋131.376 Cβ−谷甾醇＋360.391 C醇溶性浸出物−375.952C总灰分＋100.211 C酸不溶性灰分）/[1＋exp(−349.168−523.798 C白薇苷A＋233.005C白薇苷B＋247.375 C白前苷B−591.277 C熊果酸−181.273C胡萝卜苷＋131.376 Cβ-谷甾醇＋360.391 C醇溶性浸出物−375.952 C总灰分＋100.211C酸不溶性灰分）]

P差＝exp(−43.155−67.901C白薇苷A＋35.405 C白薇苷B＋54.269 C白前苷B−107.248 C熊果酸−77.947 C胡萝卜苷−85.448 Cβ-谷甾醇−189.936 C醇溶性浸出物＋629.724 C总灰分−927.724 C酸不溶性灰分）/[1＋exp(−43.155＋67.901 C白薇苷A＋35.405 C白薇苷B＋54.269 C白前苷B−107.248C熊果酸−77.947C胡萝卜苷−85.448Cβ-谷甾醇−189.936 C醇溶性浸出物＋629.724C总灰分−927.724C酸不溶性灰分）]

2.3.2  白前等级预测  将白前药材中白薇苷A、白薇苷B、白前苷B、熊果酸、胡萝卜苷、β-谷甾醇、醇溶性浸出物、总灰分和酸不溶性灰分实测值分别代入上述公式中，计算各批次白前样品属于相应等级概率，概率P值越接近100%表明预测结果更可靠，对36批白前样品进行等级预测。结果显示36批白前药材中，S25～S36预测为优级的概率P值依次为100.00%、100.00%、99.93%、100.00%、100.00%、100.00%、100.00%、99.91%、100.00%、100.00%、100.00%和99.7%；S1～S11预测为良级的概率P值依次为100.00%、100.00%、99.25%、100.00%、100.00%、99.01%、100.00%、100.00%、98.33%、100.00%和100.00%；S12～S24预测为差级的概率P值依次为100.00%、100.00%、100.00%、100.00%、99.70%、100.00%、100.00%、100.00%、100.00%、99.08%、100.00%、98.82%和100.00%。各批次等级概率P值均＞98.0%，Logistic建模拟合结果与初步分级结果一致。Logistic回归模型结果与化学计量学FA分类结果一致，表明Logistic回归模型可用于白前药材的等级预测。

3  讨论

3.1  供试品溶液制备方法的选择

本实验以白薇苷A、白薇苷B、白前苷B、熊果酸、胡萝卜苷、β-谷甾醇的综合提取率为指标，制备供试品溶液时，考察了70%乙醇、乙醇、70%甲醇、甲醇和水超声提取和回流提取30、45、60 min。结果以70%甲醇加热回流45 min时，6个成分待测成分能够提取完全，且杂质不干扰检测。

3.2  检测波长及色谱条件的确定

采用DAD检测器，在200～400 nm波段扫描对照品溶液，结果发现在210 nm处能反映较为丰富的色谱信息，同时基线较平稳，故选择210 nm作为检测波长。考虑到磷酸溶液不存在末端吸收，采用乙腈为有机相，水、0.05%、0.1%和0.2%磷酸为水相进行试验，结果发现乙腈-0.2%磷酸溶液为流动相时，白薇苷A、白薇苷B、白前苷B、熊果酸、胡萝卜苷、β-谷甾醇分离效果较好。

3.3  目标成分及内参物的选择

白前具有降气、消痰、止咳的功效，本研究选择了活性明确，含量较高的代表成分作为白前质量控制的指标性成分进行QAMS法的含量测定，主要包括皂苷类成分白薇苷A[24]、白薇苷B[25]和白前苷B[26]，五环三萜类成分熊果酸[27]，甾醇类成分胡萝卜苷、β-谷甾醇[28]。其中白薇苷A对甲病毒属RNA病毒有选择性抑制作用，能够剂量相关性的抑制烟草花叶病毒，且无细胞毒性[29]；白薇苷B能抑制碳酰胆碱和乙酰胆碱引发的气管收缩[25]，发挥治疗咳嗽的效果；白前苷B具有抗肿瘤、免疫调节、抗病毒等作用[30]。熊果酸可通过激活caspase蛋白酶活性、调控B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白表达水平诱导细胞凋亡，调节炎症因子核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的活性及其免疫因子改善肿瘤相关炎症和微环境，对多种肿瘤细胞系发挥显著抗肿瘤作用。还具有良好的抗菌作用及抗氧化作用[31]。胡萝卜苷通过降低p38磷酸化水平而降低NF-κB核易位并抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）活化，防止肝脏氧化应激和脂质，从而有效地保护酒精引起的肝损伤，在许多慢性炎症性疾病中发挥抗炎和抗氧化作用[32]。β-谷甾醇可抑制表皮细胞、巨噬细胞中炎症小体NLRP3的激活而具有抗炎作用[33]。因此，选择以上6个成分作为目标成分。参照QAMS法建立指南，选择质量稳定、价格低廉、保留时间适中的熊果酸作为内参物。以熊果酸为内参物时，各成分f的RSD值均＜2.0%，同时不同仪器、不同色谱柱、不同体积流量、不同柱温对f影响不大（RSD值均＜2.0%），且不同仪器、不同色谱柱对各成分相对保留时间值影响不大（RSD值均＜2.0%），表明选择熊果酸为内参物建立的QAMS法是可行的。

本研究建立了QAMS法的质量控制方法，一次分析中可同时检测6个成分含量，发挥了QAMS法的简便、经济的优点。以熊果酸为内参物，白薇苷A、白薇苷B、白前苷B、胡萝卜苷、β-谷甾醇的f分别为0.851 4、1.272 7、0.623 2、0.740 0、1.068 7，且RSD值均＜2.0%，以QAMS法和ESM法得到的36批白前中6个成分含量结果之间差异较小，提示所建立方法准确、可信度高，值得推广普及。检测结果表明白薇苷B和白前苷B含量较高，是白前的主要药效成分。但不同产区白前中6个成分含量差异较大，白薇苷A和胡萝卜苷差异最大（超过2.5倍）。因醇溶性浸出物、总灰分、酸不溶性灰分也是中药材质量评价中重要的理化鉴定指标，同时根据《中国药典》检测了36批白前样品中醇溶性浸出物、总灰分、酸不溶性灰分的含量，结果醇溶性浸出物为15.4%～28.9%、总灰分为3.6%～9.6%、酸不溶性灰分为1.1%～4.4%，这3个指标检测结果均差异较大，可能与样品的生长环境差异较大相关。结合化学计量学对36批白前中6个成分QAMS法含量数据及醇溶性浸出物、总灰分和酸不溶性灰分数据进行分析，结果PCA得分图显示相邻产地的样品聚集集中，质量较接近，但产地相距远的批次散点分散，验证了不同产地白前中各目标成分含量差异较大；深入挖掘数据信息发现白前苷B、白薇苷B、β-谷甾醇的VIP值大于1，是白前的质量差异因子，为白前质控指标的选择提供参考；因子分析法结果显示各变量的综合得分值在−1.225～0.966，同样表明各批次间白前质量差异较大，以S25和S26批次白前质量最优，与文献基本一致[8]，湖北的这2个产区为白前的道地产区，其次安徽、江西和浙江产地白前药材的F值也高于其他产区，提示这几个产地也可以纳入白前道地产区，为白前产区开发研究提供了参考。Logistic回归模型能够快速准确对不同产地白前药材等级进行有效预测，预测分级结果与PCA、因子分析结果基本一致。

本实验建立的QAMS方法可同时检测白前中白薇苷A、白薇苷B、白前苷B、熊果酸、胡萝卜苷、β-谷甾醇的含量，且准确、快速、经济；化学计量学、因子分析法及Logistic回归模型可用于白前的质量差异性分析评价，为其资源开发及其道地性研究提供科学依据。但也存在一定不足，如样品收集批次有限、仅对柳叶白前进行了样品收集及分析，后期将扩大样品采集范围和收集批次，同时对芫花白前开展研究，为进一步验证方法的适应性提供数据参考。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）
来  源：董双涛，徐丽霞，高建平，李宝霞．基于一测多评定量联合化学计量学及Logistic回归模型的白前质量等级预测  [J]. 中草药, 2024, 56(2): 656-666.
中草药杂志社
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失巢凋亡调控重症哮喘患者不同炎症表型的气道重塑机制及其潜在靶向 中药化合物的预测
青风藤-白芍药对不同配伍比例化学成分与抗炎活性变化规律研究
基于网络药理学与分子对接探讨钩吻素甲对舌鳞状细胞癌增殖与凋亡的影响
UPLC-Q-TOF-MS/MS结合网络药理学、分子对接技术及实验验证预测瑶药三妹木抗炎作用的质量标志物（Q-Marker）
基于细胞实验、网络药理学和分子对接探究苯乙醇苷类成分的促神经再生作用构效关系及机制
基于历史传承和科学内涵的植物药材道地性综合评价
狼毒大戟中的酚酸化合物及α-葡萄糖苷酶抑制活性研究
共载姜黄素及顺铂pH敏感脂质体制备及其体外抗乳腺癌活性评价
基于智能感官和近红外光谱技术结合化学计量学的酒当归炮制程度快速辨识研究
改进YOLOv8在中药饮片自动识别标注中的研究与应用
经典名方薏苡附子败酱散的基准样品量值传递研究
领取F5000证书一一《中草药》入选论文22篇
“一带一路”视域下药食两用本草桑叶科学研究的可视化分析及知识图谱构建
整合16S rRNA测序技术和代谢组学探究白鲜皮对斑马鱼幼鱼的肝毒性机制
数据挖掘《中国药典》2020年版肾病相关中药成方制剂的核心药对及其作用靶点预测
基于指纹图谱和多成分测定研究不同类型黄酒对酒黄芩饮片质量的影响
川产道地药材蓬莪术醋制入肝调控“肠-肝轴”的增效机制研究
荔枝核总黄酮通过改善肠道菌群结构减轻四氯化碳诱发的肝纤维化
EMA“证明用于哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD）的经口吸入制剂（OIP）治疗等效性（TE）要求指导原则”介绍及其启示
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