共载姜黄素及顺铂pH敏感脂质体制备及其体外抗乳腺癌活性评价

学术 2025-01-16 07:58 天津

癌症长期以来一直是研究热点，近年来癌症发病率呈年轻化趋势，社会经济负担沉重，2022年统计数据显示，全球新增癌症病例近2 000万例，近1 000万例死亡，其中乳腺癌病例数仅次于肺癌，成为威胁人类生命健康的第2大疾病，严重影响患者身心健康^[1]。其治疗手段从手术、化疗、放疗，再到内分泌治疗与免疫治疗，不断更新，但化疗仍是晚期乳腺癌的主要临床治疗手段。顺铂（cisplatin）作为治疗乳腺癌的一线化疗药物，通过与DNA上的嘌呤碱基相互作用产生DNA损伤，激活多种信号转导途径，最终导致细胞凋亡^[2]，但因其具有严重的肝、肾等不良反应，易产生耐药性，使其临床应用受到极大限制。其产生耐药性的机制非常复杂，包括DNA损伤修复、细胞内顺铂有效浓度降低、细胞自噬、易感基因、免疫反应以及相关信号通路等^[3]。目前，临床上多采用顺铂联合其他药物同时给药，以减轻顺铂不良反应、克服其耐药性，从而提高其抗乳腺癌效果^[4]。

中药具有多成分、多靶点、多通路、低毒、增效、经济等优势，在克服肿瘤耐药性的治疗中发挥着重要作用^[5]。姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄Curcuma longa L.、温郁金C. wenyujin Y. H. Chen et C. Ling等根茎中提取得到的一种多酚类化合物^[6]，具有抗炎、抗氧化、抗癌、调血脂^[7]等多种药理作用。姜黄素分子结构中含有α,β-不饱和二酮基，且在2个苯环上分别含有酚羟基和甲氧基，酮-烯醇部分可与金属螯合，能够清除活性自由基，使姜黄素可以成为氢离子的供体或受体，从而产生抗炎、抗氧化作用^[8]。姜黄素还可以调节多种信号途径发挥抑制肿瘤细胞增殖、生长、侵袭、转移，阻止肿瘤新生血管生成以及诱导肿瘤细胞凋亡^[9]，抗癌谱较广，对多种癌症均有作用，包括乳腺癌、肝癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌等^[10]。

近年来对姜黄素抗癌作用研究较多^[11-12]，且其在对抗乳腺癌在内的各种肿瘤耐药性方面效果显著，例如，过度表达乳腺癌细胞系的皮瓣内切酶1，可促进该细胞系对化疗药物顺铂的耐药性，姜黄素可以通过下调皮瓣内切酶1的表达，从而提高乳腺癌细胞对顺铂的敏感性^[13]。作为药食同源植物来源的化学药，姜黄素不良反应小^[14]，与临床抗肿瘤药物联合应用具有一定的协同作用，能有效地抑制癌细胞生长，降低化疗药物的不良反应，减少化疗药物剂量，达到增效减毒的效果^[15]。但姜黄素存在的水溶性差、生物利用度低和代谢快^[16]等缺点，使其治疗癌症的效果大大降低。

联合给药能够在一定程度上增强化疗药物的治疗效果，降低不良反应，但不同药物在体内的药动学过程存在差异，使得联合给药后很难以最佳药物比例同步释放到肿瘤部位^[17]。卡铂和紫杉醇联合给药作为临床术后的辅助治疗，治疗初期疗效较好，但治疗后的复发率却高达70%，因此，增强化疗药物的药效，降低其不良反应成为临床急需解决的问题^[18-20]。

脂质体作为一种优良的药物载体，能够保护药物免受外界因素的影响，提高药物的生物利用度，增强药物的治疗作用、磷脂双分子层结构生物相容性好，能够包裹水溶性或脂溶性药物，增加药物溶解度、具有治疗靶向性，减少药物对正常细胞的损伤，降低药物的不良反应等特点，常作为化疗药物的载体用于癌症的治疗^[21]，赵璐丹^[22]将新鱼腥草素钠与顺铂以最佳协同比例共载于脂质体中，可以同步两药的体内过程，使其按最佳比例释放药物，达到较好治疗肺癌的效果。但共载脂质体仍然存在一些问题，如药物包裹在脂质体内，可能导致药物释放缓慢、主动靶向性和稳定性较差，因脂质体在血液中快速清除而导致药物疗效降低，对一些疾病的靶向性不强等^[23-24]。

为解决上述问题，本实验根据肿瘤部位癌细胞代谢活性高、血流灌注不足等，引起酸性代谢产物在肿瘤微环境中积聚，使得肿瘤微环境偏酸性的特点^[25-26]，制备了共载姜黄素和顺铂的pH敏感脂质体（cisplatin and curcumin co-loaded pH sensitive liposome，CCL），研究两药联用按最佳协同比例同步释药的规律，并对共载脂质体进行修饰，增加了pH敏感材料，拟使其在肿瘤偏酸性环境下快速释放药物，增强药物的靶向性，以期改善姜黄素的水溶性差、生物利用度低和顺铂严重不良反应等问题，从而提高体外抗乳腺癌活性。本实验期望能对乳腺癌的治疗提供新的治疗方案，也为后续用于癌症治疗的新型纳米制剂研究提供新思路。

1 仪器与材料

1.1 仪器

MF52-N型倒置荧光显微镜，广州市明美光电技术有限公司；DMil LED型倒置显微镜，德国Leica公司；Multiskan FC型酶标仪，赛默飞世尔（上海）仪器有限公司；90Plus PALS型纳米激光粒度仪，美国布鲁克海文仪器公司；Agilent 1260型高效液相色谱仪（HPLC），安捷伦科技（中国）有限公司；ST8R型小型台式高速冷冻离心，云南泰比经贸有限公司；Scientz-IID型超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；RE212-B型旋转蒸发仪，倍捷科技有限公司；BPN-190CH型二氧化碳培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；HT7800型透射电子显微镜（TEM），武汉金开瑞生物工程有限公司；pHS-25型实验室pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；OHAUS型分析天平，云南中检测试科技有限公司。

1.2 试剂与材料

磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE，质量分数≥80.0%，批号J13IS217327）、姜黄素对照品（批号M13GB148382，质量分数≥98.0%）、胆甾醇半琥珀酸酯（cholesteryl hemisuccinate，CHS，质量分数≥97.0%，批号JS240605），均购自上海源叶生物科技有限公司；顺铂对照品/原料药（质量分数99.9%，批号S20230415），昆明贵研药业有限公司；脱氧胆酸钠（批号623L021）、姜黄素原料药（质量分数95.0%，批号114G0215）、二甲基亚砜（批号3231026003），均购自北京Solarbio公司；胎牛血清（批号2222094）、青霉素-链霉素（批号2233204）、磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS，批号2416174），均购自上海达特希尔生物科技有限公司；CCK-8试剂（批号ATWD07091），亚科因（武汉）生物技术有限公司；三氯甲烷（批号20211029），云南杨林工业开发区汕滇药业有限公司；0.9%氯化钠注射液（生理盐水），批号2308182BD，西安京西双鹤药业有限公司；胰酶（批号GA2402007）、DAPI染色试剂（批号CR2307030）、DMEM培养基（批号GP23020040046），均购自武汉赛维尔生物科技有限公司；甲醇、乙腈色谱纯，默克股份两合公司；丙二醇（批号20220901406）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）400（批号20240201529），均购自天津市致远化学试剂有限公司；聚山梨酯80，批号EZ653FAE38，上海久心研生物科技有限公司。

1.3 细胞株

正常肝L02细胞、乳腺癌4T1细胞，均由云南中医药大学药剂实验室提供。

1.4 动物

SPF级KM小鼠，雄性，体质量（20±2）g，购自昆明楚商科技有限公司，本课题经云南中医药大学动物实验伦理委员会批准，伦理编号为R-062024008，饲养于云南中医药大学实验动物中心，使用许可证号为SYXK（滇）K2022-0004。

2 方法与结果

2.1 CCK-8法考察姜黄素和顺铂对4T1细胞的增殖抑制作用

2.1.1 单独用药将贴壁生长的4T1细胞置于CO₂培养箱中培养，待细胞生长至90%左右时，稀释细胞数为2×10⁵个/mL并种板，设置空白组、对照组和给药组，每组5个复孔，每孔100 μL，继续培养24 h后，吸弃培养基，空白组加入PBS 100 μL，对照组加入正常培养基100 μL，给药组分别加入8个质量浓度梯度的姜黄素和顺铂含药培养基100 μL；继续培养24 h后，用PBS清洗2遍，每孔加入100 μL/mL的含CCK-8溶液的培养基100 μL，继续培养2 h后用酶标仪在450 nm处测其吸光度（A）值，并计算其细胞存活率。

细胞存活率＝(A_给药－A_空白)/(A_对照－A_空白)

结果如表1所示，两药单独使用时对于4T1细胞增殖抑制具有质量浓度相关性，质量浓度越高，细胞存活率越低，抑制作用越强，但姜黄素表现出增殖抑制作用的最低质量浓度约为顺铂的7.5倍，表明顺铂对4T1细胞的增殖抑制作用比姜黄素强。

2.1.2 联合用药固定顺铂的质量浓度（1.75、2.00、2.25、2.50、3.75 μg/mL），增加姜黄素的量，设置顺铂-姜黄素的质量浓度比为1∶1、1∶2、1∶4、1∶6，操作同“2.1.1”项，计算顺铂-姜黄素不同联用比例的细胞存活率，结果如表2所示。顺铂-姜黄素不同联用比例组均比顺铂单用组的细胞增殖抑制作用强，且细胞增殖抑制作用强弱与联用比例的大小呈正相关，表明将2种药物联用能起到更好的抗肿瘤作用。

2.2 半效法筛选姜黄素和顺铂联合用药的最佳比例

根据“2.1.1”和“2.1.2”项下姜黄素和顺铂单用及联用结果，运用半效法^[27]筛选两药联用的最佳比例。半效法相关计算公式如下。

lg(fa/fu)＝m lgD－m lgD_m

fa为不同药物质量浓度下的细胞增殖抑制率，fu＝1－fa，D代表药物质量浓度，D_m为半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC₅₀），m为斜率

假设b＝m，a＝m lgD_m，Y＝lg(fa/fu)，X＝lgD，则Y＝bX＋a；以X为因变量，Y为自变量，建立回归方程。

CI＝D₁/D_x₁＋D₂/D_x₂

D_x₁、D_x₂分别表示药物姜黄素、顺铂单用时达到一定抑制作用时的药物质量浓度，D₁、D₂表示姜黄素和顺铂联用时达到一定抑制作用时的药物质量浓度

应用Graphpid 8.0.2软件计算两药在不同联用比例下的IC₅₀值，应用CompuSyn 1.0软件计算药物联用指数（combination index，CI），结果如表3

所示。顺铂的IC₅₀值比姜黄素低，表明顺铂对4T1细胞的增殖抑制能力比姜黄素强；两药联用后，不同联用比例下的IC₅₀值均比顺铂单用的IC₅₀值低，且随着顺铂-姜黄素联用比例的增大，对应的IC₅₀值呈下降趋势，表明姜黄素能增强顺铂对4T1细胞的杀伤能力。

以效应fa为横坐标，CI为纵坐标，绘制出不同联用比例下姜黄素和顺铂的CI关于fa的曲线，结果见图1。图中在CI＝1.0处有一条平行直线，线上方（CI＞1.0）表示2种药物联用后产生拮抗作用；线下方（CI＜1.0）表示协同作用，CI值越小，协同作用越强；线上（CI＝1.0）表示相加作用。结果如图1所示，顺铂-姜黄素（1∶4）的曲线在fa＞0.7时CI＞1.0，在线上方，发挥拮抗作用；顺铂-姜黄素（1∶1、1∶2、1∶6）的曲线在fa≤0.8时CI＜1.0，均在线下方，发挥协同作用。

一般选用fa在0.5～0.8的区域来评价2种药物联用抗肿瘤的效果^[28]。从图1中可以看出，顺铂-姜黄素（1∶1、1∶2、1∶6）的曲线fa在0.5～0.8时CI值均在平行线下方，且除fa＝0.5外，顺铂-姜黄素（1∶6）的曲线fa在该区域内对应的CI值均最小，表明该联用比例能发挥最佳的抗肿瘤作用。故选择顺铂-姜黄素（1∶6）制备CCL。

2.3 CCL的制备

采用薄膜分散法制备CCL。精密称取处方量的PE、CHS和3 mg姜黄素溶于三氯甲烷中，超声完全溶解后，置于旋转蒸发仪上45 ℃、70 r/min条件下减压蒸发至圆底烧瓶内壁出现黄色均匀薄膜；精密称取处方量脱氧胆酸钠和0.5 mg顺铂溶于生理盐水中作为水化液；将水化液加入上述圆底烧瓶中，水化后超声，滤过，即得CCL混悬液5 mL；4 ℃冰箱避光保存。除不加顺铂外，同上述方法制备姜黄素脂质体（curcumin liposomes，Cur-L）；除不加姜黄素外，同上述方法制备顺铂脂质体（cisplatin liposome，Cis-L）；除不加姜黄素和顺铂外，同上述方法制备空白脂质体（blank liposome，B-L）。

2.4 顺铂和姜黄素含量测定方法的建立

2.4.1 色谱条件

（1）姜黄素：色谱柱为Zorbax Eclipse Plus C₁₈柱［250 mm×4.6 mm，5 μm，安捷伦科技（中国）有限公司）］；流动相为乙腈-4%冰醋酸水溶液（56∶44）；体积流量1.0 mL/min；检测波长425 nm；进样量10 μL；柱温30 ℃^[29]。

（2）顺铂：色谱柱为NuovaSil NH₂（250 mm×4.6 mm，5 μm，谱立科技有限公司）柱；流动相为乙腈-甲醇-0.9%氯化钠水溶液（65∶25∶10）；体积流量0.6 mL/min；检测波长220 nm；进样量10 μL；柱温30 ℃^[30]。

2.4.2 线性关系考察精密称取姜黄素对照品4.16 mg、顺铂对照品3.20 mg，分别置于5 mL量瓶中，姜黄素加甲醇定容至刻度，得到质量浓度为832 μg/mL的姜黄素对照品溶液；顺铂加生理盐水定容至刻度，得到质量浓度为640 μg/mL的顺铂对照品溶液；分别稀释至不同质量浓度，滤过，按照“2.4.1”项下色谱条件进行测定，绘制峰面积（Y）对质量浓度（X）的标准曲线，进行线性回归，得到姜黄素回归方程Y＝92.627 X＋10.818，R²＝0.999 8，顺铂回归方程Y＝8.871 X＋4.340 7，R²＝1.000 0；结果表明姜黄素在1.625～208.000 μg/mL，顺铂在1.000～320.000 μg/mL线性关系良好。

2.4.3 精密度试验分别将“2.4.2”项下姜黄素对照品溶液稀释为低（3.25 μg/mL）、中（13.00 μg/mL）、高（52.00 μg/mL）3个质量浓度，顺铂对照品溶液稀释为低（5 μg/mL）、中（20 μg/mL）、高（80 μg/mL）3个质量浓度；分别滤过后进样，1 d内重复测定3次，计算日内精密度，连续进样3 d，计算日间精密度。结果姜黄素日内精密度的RSD分别为0.18%、0.26%、0.08%，日间精密度的RSD分别为0.43%、0.18%、0.19%；顺铂日内精密度的RSD分别为2.38%、1.50%、0.70%，日间精密度的RSD分别为2.44%、1.70%、0.25%；结果表明该仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验精密吸取1 mL的CCL混悬液置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至10 mL，超声破乳10 min，0.22 μm微孔滤膜滤过后作为供试品溶液。分别于制备后0、2、4、6、8、10、12、24 h，进样检测，记录峰面积，姜黄素峰面积的RSD为0.26%，顺铂峰面积的RSD为1.23%，结果表明供试品溶液在室温放置24 h内基本稳定。

2.4.5 重复性试验取同一批制备的CCL混悬液，按“2.4.4”项下方法分别制备成6份供试品溶液，进样检测，记录峰面积，结果表明，姜黄素质量分数的RSD为0.17%，顺铂质量分数的RSD为1.30%，结果表明此法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验分别精密量取姜黄素对照品溶液（26 μg/mL）和顺铂对照品溶液（40 μg/mL）0.5、1.0、1.5 mL，加入到0.5 mL B-L混悬液中，各平行3组；用甲醇破乳定容至10 mL，得到姜黄素质量浓度分别为1.30、2.60、3.91 μg/mL，顺铂质量浓度分别为2、4、6 μg/mL。分别测定峰面积，计算加样回收率。姜黄素低、中、高质量浓度的平均加样回收率分别为97.18%、96.15%、97.79%，RSD分别为0.88%、0.80%、0.66%，顺铂低、中、高质量浓度的平均加样回收率分别为100.33%、99.75%、98.11%，RSD分别为1.52%、1.64%、2.32%；表明该法测定姜黄素和顺铂含量，回收率高，准确可靠。

2.5 CCL包封率及载药量测定

取CCL混悬液2份，1 500 r/min低速离心15 min，使未包封进脂质体的药物通过离心沉淀除去；取上层液体2份，1份加浓硝酸使其充分溶解，离心，取上清液进样分析，测定包封进CCL中的顺铂含量（W_顺铂）^[28]；1份加甲醇使其充分破乳，离心，取上清液进样分析，测定包封进CCL中的姜黄素含量（W_姜黄素）^[31]。直接取CCL混悬液2份，分别加入硝酸和甲醇进行溶解和破乳，分别测定顺铂和姜黄素总含量（W_总顺铂和W_总姜黄素）。

根据“2.2”项下筛选出的顺铂和姜黄素最佳联用比例，计算CCL中姜黄素和顺铂的综合包封率和载药量，其中姜黄素包封率占综合包封率的85.71%（6/7），顺铂包封率占综合包封率的14.29%（1/7）。

综合包封率＝W_姜黄素/W_总姜黄素×85.71%＋W_顺铂/W_总顺铂×

14.29%

载药量＝W_顺铂或W_姜黄素/(W_总姜黄素＋W_总顺铂＋W_辅料)

W_辅料为制备CCL时加入的辅料量

2.6 CCL制备处方工艺优化

2.6.1 单因素考察参照“2.3”项下方法制备，分别考察药脂比、胆脂比、膜软化剂种类、脱氧胆酸钠用量、水化液种类、超声功率、超声时间、水化时间对CCL粒径、ζ电位、多分散指数（polydispersity index，PDI）和综合包封率的影响。

药脂比考察时，固定姜黄素3 mg、顺铂0.5 mg，分别在药脂比为1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50条件下制备CCL，结果如表4所示，药脂比为1∶30时综合包封率最高，继续增加药脂比，综合包封率降低，故选择药脂比1∶30。

胆脂比考察时，固定药脂比为1∶30，分别在胆脂比为1∶3、1∶5、1∶7、1∶10、1∶15条件下制备CCL，结果如表5所示，胆脂比为1∶10时，综合包封率最高，继续增加胆脂比，综合包封率降低，故选择胆脂比1∶10。

膜软化剂种类考察时，固定药脂比为1∶30、胆脂比为1∶10，分别用脱氧胆酸钠、丙二醇、聚山梨酯80、PEG 400为膜软化剂制备CCL，结果如表6所示，膜软化剂为脱氧胆酸钠时综合包封率最高，在制备过程中发现，膜软化剂为丙二醇和PEG 400时，圆底烧瓶内形成的薄膜并未被完全水化下来，膜软化剂为聚山梨酯80时，其制剂ζ电位和PDI均比膜软化剂为脱氧胆酸钠时的ζ电位及PDI大，综合考虑，选择膜软化剂为脱氧胆酸钠。

脱氧胆酸钠用量考察时，固定药脂比为1∶30、胆脂比为1∶10，分别在脱氧胆酸钠用量为5、10、20、30、40、50 mg条件下制备CCL，结果如表7所示，脱氧胆酸钠用量为10 mg时，其综合包封率最高，继续增加其用量，综合包封率有所降低，且粒径增大到一定程度后会突然减小，PDI变大，制剂不稳定，故选择脱氧胆酸钠用量为10 mg。

水化液种类考察时，固定药脂比为1∶30、胆脂比为1∶10，脱氧胆酸钠用量为10 mg，分别用纯化水、PBS、生理盐水为水化液制备CCL，结果如表8所示，水化液为生理盐水时，综合包封率最高，故选择生理盐水作为水化液。

超声功率考察时，固定药脂比为1∶30、胆脂比为1∶10，脱氧胆酸钠用量为10 mg，水化液为生理盐水，分别在超声功率为150、200、250、300、350 W条件下制备CCL，结果如表9所示，超声功率为250 W时，综合包封率最高，ζ电位绝对值最大，表明该条件下制剂最稳定，故选择超声功率为250 W。

超声时间考察时，固定药脂比为1∶30、胆脂比为1∶10，脱氧胆酸钠用量为10 mg，水化液为生理盐水，超声功率为250 W，分别在超声时间为2、6、10、15 min条件下制备CCL，结果如表10所示，虽然超声时间在6 min时，综合包封率并不是最高，但与2 min相比，差别不大，且超声时间为6 min时的PDI值比超声时间2 min的PDI值明显减小，故选择超声时间为6 min。

水化时间考察时，固定药脂比为1∶30、胆脂比为1∶10，脱氧胆酸钠用量为10 mg，水化液为生理盐水，超声功率为250 W，超声时间为6 min，分别在水化时间为30、45、60 min条件下制备CCL，结果如表11所示，水化时间为30 min时，综合包封率最大，且ζ电位绝对值最大，比水化时间为45、60 min条件下制备的制剂更稳定，故选择水化时间为30 min。

2.6.2 Box-Behnken设计结合响应面法（Box-Behnken design combined with response surface method，BBD-RSM）优化根据“2.6.1”项下单因素考察实验结果，药脂比（X₁）、胆脂比（X₂）及脱氧胆酸钠用量（X₃）对药物的综合包封率影响较大，故选择此3个单因素作为主要考察对象，以两药的综合包封率为响应值进行进一步的BBD-RSM交互效应考察，实验设计与结果见表12。

用Design-Expert 13软件进行回归拟合，得到拟合方程Y＝95.700＋0.018 8 X₁＋0.225 0 X₂＋2.020 X₃＋0.252 5 X₁X₂－0.550 0 X₁X₃＋0.457 5 X₂X₃－2.350 X₁²－2.770 X₂²－4.890 X₃²，R²＝0.974 6，P＜0.05，表明该模型显著，无失拟因素存在，真实可信，实验误差较小，能较好地反映各因素与响应值之间的关系。用Design-Expert 13软件绘制各因素与综合包封率的效应面图与等高线图，结果如图2所示，交互因素中X₁与X₂的效应面较平缓，椭圆形不明显，而X₁与X₃、X₂与X₃的等高线均呈明显椭圆形，说明后2者交互作用更为突出，对综合包封率影响更显著。Design-Expert 13软件优化的结果为药脂比1∶29.83，胆脂比1∶11.23，脱氧胆酸钠用量14.08 mg，预测综合包封率为95.92%。

2.6.3 最优处方工艺确定及验证实验以药脂比、胆脂比、脱氧胆酸钠用量为单因素，两药的综合包封率为响应值进行BBD-RSM实验，优化出CCL最佳制备处方工艺为姜黄素3 mg、顺铂0.5 mg、PE 104.41 mg、CHS 9.30 mg、脱氧胆酸钠用量14.08 mg、水化液为生理盐水、超声功率为250 W、超声时间为6 min、水化时间为30 min，按“2.3”项下方法制备CCL。对最佳处方工艺进行验证实验，结果CCL中姜黄素和顺铂的综合包封率为（94.09±0.46）%（n＝3），载药量分别为（1.43±0.13）%、（0.30±0.05）%（n＝3）。验证结果显示，RSD值均小于1%，且综合包封率与预测值95.92%接近，表明响应面优化的参数条件准确可靠。

2.7 CCL的表征

2.7.1 粒径、ζ电位及PDI测定将按最优处方工艺制备好的CCL，在pH 7.0条件下稀释数倍后转移至比色皿中，用激光粒度仪测定其在该条件下的粒径、ζ电位和PDI；将CCL在pH 5.0条件下稀释数倍后，在磁力搅拌器中37 ℃恒温搅拌30 min后测定其粒径、ζ电位和PDI。结果如图3所示，CCL在pH 7.0条件下的粒径为（156.54±2.56）nm，ζ电位为（−34.48±2.67）mV，PDI为0.21±0.03；在pH 5.0条件下的粒径为（318.92±12.82）nm，ζ电位为（−11.07±1.05）mV，PDI为0.33±0.03。

2.7.2 储存稳定性考察将按最优处方工艺制备好的CCL在第0、1、5、10、15、20、30天时分别测定其粒径、ζ电位和PDI，考察CCL的储存稳定性。结果（表13）显示，CCL在1个月内的粒径、ζ电位和PDI均无明显变化，表明该处方工艺制备的CCL储存在4 ℃条件下30 d内稳定性良好。

2.7.3 形态观察将按最优处方工艺制备好的CCL稀释1.5倍后滴加到碳膜铜网的覆膜面上，上膜5 min，吸水纸吸去多余液体，用2%磷钨酸染色后，晾干铜网，TEM下观察。结果如图4-A所示，在pH 7.0条件下，TEM下CCL的形态较规整，呈现类球形，边缘光滑圆整，无裂纹，分散均匀。

2.7.4 pH敏感性测试将制备好的CCL在pH 5.0条件下稀释1.5倍后，在磁力搅拌器中37 ℃恒温搅拌30 min后进行TEM拍摄，结果如图4-B所示，TEM下CCL形态不规则，边缘出现裂痕，综合“2.7.1”项下结果，将pH 5.0与pH 7.0条件下CCL粒径、ζ电位绝对值进行比较，发现在pH 5.0时，CCL粒径增大，约为pH 7.0条件下的2倍；ζ电位绝对值减小，表明CCL在pH 5.0条件下具有敏感性，粒径容易增大甚至破裂。

2.8 体外释放实验

采用透析袋法^[32]考察CCL体外释放情况，精密量取制备好的游离姜黄素及顺铂混合液（free cisplatin and curcumin，FCC，投药总量及其比例均同CCL，顺铂-姜黄素1∶6）、CCL各2 mL，放入已活化的相对分子质量为3 000的透析袋中，配制含有1%聚山梨酯80^[33]和25%乙醇的PBS 20 mL作为体外透析液，调节pH值为5.0和7.0，将FCC和CCL放入透析液中，瓶口密闭，在37 ℃、100 r/min磁力搅拌器中搅拌，分别于1、2、4、6、8、12、24、48、72 h取样1 mL，同时补加1 mL新鲜介质，滤过后用HPLC法测定姜黄素和顺铂的含量，计算累积释放率，结果如图5所示。

FCC中姜黄素在pH 5.0和pH 7.0条件下24 h内累积释放率分别为（84.08±0.94）%、（84.08±0.94）%；顺铂在pH 5.0和pH 7.0条件下24 h内累积释放率分别为（87.21±1.99）%、（85.07±1.63）%；在不同pH条件下FCC中同一药物累积释放率基本一致，基本不受pH环境影响（P＞0.05）。CCL中姜黄素在pH 5.0和pH 7.0条件下72 h内累积释放率分别为（80.64±1.5）%、（57.93±0.95）%；顺铂在pH 5.0和pH 7.0条件下72 h内累积释放率分别为（85.5±2.07）%、（65.07±2.01）%，在pH 7.0条件下两药均释放较少，表明CCL在近生理环境下具有缓释作用；与pH 7.0比较，CCL在pH 5.0条件下两药均释放较多（P＜0.001），表明CCL具有一定的pH敏感性。对其进行零级释放、一级释放、Higuchi、Ritger-Peppas模型拟合，结果如表14所示，不同释放曲线均符合一级动力学模型方程。

累积释放率＝(C_nV＋C_iV_i)/W

C_i和C_n分别表示第i次取样和第n次取样时，释放介质中姜黄素或顺铂的质量浓度；V表示释放介质的体积，即20 mL；V_i表示第i次的取样体积，即1 mL；W表示FCC和CCL中姜黄素或顺铂的总质量

2.9 体外抗肿瘤活性研究

2.9.1 细胞增殖抑制能力检测 4T1细胞种板与给药按照“2.1”项下方法操作，分别设置空白组、对照组、B-L组、游离姜黄素（free curcumin，F-Cur）组、Cur-L组、游离顺铂（free cisplatin，F-Cis）组、Cis-L组、FCC组和CCL组，通过CCK-8试剂盒测定A值，计算细胞存活率，并与其相应的游离药物组进行比较，结果如表15所示。

B-L组不同质量浓度与其未给药组比较无显著性差异（P＞0.05），表明B-L质量浓度在15～35 μg/mL对4T1细胞未产生增殖抑制作用。不同给药组的4T1细胞存活率均随着质量浓度的增加而降低，表明4T1细胞存活率与药物质量浓度呈现相关性；F-Cur、Cur-L、F-Cis、Cis-L、FCC、CCL的IC₅₀值分别为（44.49±0.72）、（37.00±0.06）、（5.56±0.04）、（3.44±0.06）、（1.11±0.04）、（0.92±0.03）μg/mL，各药物脂质体组与其游离药物组比较，IC₅₀值均降低，表明制备成脂质体后药物对4T1细胞的增殖抑制作用增强，且FCC组和CCL组的IC₅₀值均比其他组单用的IC₅₀值低，进一步表明姜黄素和顺铂两药联用杀伤癌细胞的能力更强。

2.9.2 细胞迁移能力考察种板前将6孔板底部平分为3等份，取对数生长期的4T1细胞稀释到2×10⁵个/mL，种板与给药按“2.9.1”项下方法操作，分为对照组、F-Cur、Cur-L、F-Cis、Cis-L、FCC和CCL组，每孔加入2 mL，待细胞长到90%左右，用枪头在孔内划痕，使划痕与底部所划直线垂直，拍摄不同组的0 h照片；然后用含2%血清的培养基配制不同组的药物，分别于给药24、48 h时拍照，结果见图6。采用Image J 1.8.0软件处理划痕面积，计算细胞划痕面积恢复率，考察细胞迁移能力。结果如表16所示，同一时间下不同给药组与对照组，以及同一时间下不同药物脂质体组与其游离药物组间均存在显著性差异（P＜0.001），表明不同给药组均能抑制细胞迁移，且CCL组与其他给药组比较，划痕面积恢复率较低，表明CCL组抑制细胞迁移的能力比其他给药组更强。

细胞划痕面积恢复率＝(0 h划痕面积－24 h或48 h划痕面积)/0 h划痕面积

2.9.3 细胞克隆实验取对数生长的4T1细胞，分为对照、F-Cur、Cur-L、F-Cis、Cis-L、FCC和CCL组，种于6孔板中，2×10³个/孔，待细胞完全贴壁后给药，继续培养24 h后，吸弃含药培养基，PBS清洗2遍，换成不含药的完全培养基，继续培养，待看到有明显的克隆团形成时，终止培养，加入4%多聚甲醛固定15 min后，用0.1%结晶紫染色，拍照，采用Image J 1.8.0软件处理细胞克隆个数。结果如图7和表17所示，不同给药组与对照组，以及不同药物脂质体组与其游离药物组间均存在显著性差异（P＜0.01、0.001），表明不同给药组均能抑制4T1细胞克隆，且CCL组抑制4T1细胞克隆能力与其他组比较最强（P＜0.001）。

2.9.4 DAPI核染细胞凋亡的细胞形态学分析利用DAPI对细胞核进行染色，定性考察细胞凋亡的形态学变化^[34]。将4T1细胞稀释至1×10⁵个/mL，种于12孔板中，每孔1 mL，分为对照组、F-Cur组、Cur-L组、F-Cis组、Cis-L组、FCC组和CCL组，培养24 h后给药，继续培养24 h，吸弃培养基，加入4%多聚甲醛固定30 min，每孔加入500 μL DAPI（2 μg/mL）于37℃孵育10 min，在荧光倒置显微镜下观察细胞凋亡情况，结果如图8所示。对照组的细胞核结构完整，染色均一，呈现均匀蓝色荧光；其他不同给药组均出现细胞核固缩、变形或破碎，核染色质边缘化趋势，呈现蓝色荧光；其中，CCL组与F-Cur、Cur-L、F-Cis、Cis-L及FCC组比较，不仅出现明显的细胞核固缩或变形情况，细胞数目也明显减少，表明姜黄素和顺铂两药联用比其单用体外抗乳腺癌效果好，且制备成CCL后，能进一步增强抗乳腺癌效果。

2.10 体外安全性评价

2.10.1 对正常肝L02细胞的增殖抑制实验取对数生长的正常肝L02细胞，培养条件、种板数目、给药质量浓度与乳腺癌4T1细胞保持一致，分为FCC组和CCL组，计算各组药物处理后L02细胞存活率，并与4T1细胞存活率进行比较，结果如表18所示。不同质量浓度的FCC和CCL对正常肝L02细胞存活率影响较小，对L02细胞的增殖抑制作用比4T1细胞弱，且FCC对4T1细胞和L02细胞的IC₅₀值分别为（1.11±0.04）μg/mL和（4.83±0.04）μg/mL，而CCL对4T1细胞和L02细胞的IC₅₀值分别为（0.92±0.03）μg/mL和（4.50±0.02）μg/mL，FCC和CCL对L02细胞的IC₅₀值均比对4T1细胞的IC₅₀值大，表明FCC和CCL对L02细胞在1.75～3.75 μg/mL安全性较好。

2.10.2 溶血实验 KM小鼠眼球取血，装入含有肝素钠的离心管中，用生理盐水轻柔清洗3次，并配制成体积分数为2%的混悬液，FCC和CCL用生理盐水配成1.75、2.00、2.25、2.50、3.75 μg/mL，加入体积分数2%的红细胞混悬液与其混合，阴性对照为生理盐水与体积分数2%的红细胞混悬液混合，阳性对照为纯水与体积分数2%的红细胞混悬液混合，1 800 r/min，离心半径为7.6 cm，离心10 min，FCC和CCL不同质量浓度均配制1组不加红细胞混悬液，作为空白组，用于扣除姜黄素背景，于545 nm处测其A值，计算其溶血率。

溶血率＝(A_样品－A_阴性)/(A_阳性－A_阴性)

结果如图9及表19所示。FCC随着药物质量浓度的增加，溶血率有所降低，因为姜黄素中的酚羟基可以通过捐赠H原子给自由基，从而清除自由基，姜黄素中的烯醇羟基也能还原自由基，碳链上的羟基也有利于姜黄素稳定红细胞膜^[35]，FCC和CC溶血率最高的组分别为0.95%、1.17%，溶血率均低于5%，表明FCC和CCL在1.75～3.75 μg/mL生物相容性良好。

3 讨论

近年来随着纳米制剂的发展，可以选择纳米载体负载多种抗癌药物，以降低单独用药的毒性，提高治疗效果^[36]。药物联用的协同作用机制可能与药物影响了程序性细胞死亡的子程序有关，研究表明，程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）与多种类型的癌症治疗相关^[37]，PCD可以分为许多不同的子程序，包括自噬依赖性细胞死亡、凋亡、有丝分裂障碍、坏死性凋亡、铁凋亡、焦凋亡和失巢凋亡等，用小分子化合物靶向PCD的子程序已经成为一种有前景的治疗策略，其在乳腺癌的治疗中迅速取得进展，但小分子药物单用容易产生耐药性，药物联用可以增强疗效，降低耐药性，可能与调节PCD子程序相关，深入研究PCD，更准确地确定PCD各子程序的复杂分子机制，并进一步探讨它们之间的关系，对靶向治疗的发展具有重要意义。

为了增强药物的靶向性，本实验在脂质体中加入了pH敏感辅料CHS，酸性条件下脂质体粒径变大甚至破裂，促进药物在肿瘤部位释放，降低化疗药物对正常细胞的毒性^[38]。目前含PE的pH敏感脂质体药物输送系统已经广泛用于癌症的靶向治疗，Fan等^[39]研究发现PE作为一种天然的不饱和磷脂，可形成双层相和六方晶相，两相间转化能量较低。在中性pH值下极易发生相变，形成的脂质体表现出弱的pH敏感性和较低的结构稳定性。含有PE的脂质体中加入pH敏感辅料CHS后，由于CHS具有胆固醇样结构，中性pH条件下可以稳固PE脂质体的磷脂双分子层结构，防止药物泄露，增加脂质体的稳定性；同时CHS的甾体刚性结构在酸性环境下使PE脂质体表面形态由双层相向六方晶相转变，磷脂双分子层结构被破坏，药物释放增加，展现出较好的pH敏感性。

这可能与以下机制有关：（1）当pH值降低时，PE的氨基和磷酸基团以及CHS均被质子化，减弱了CHS与PE之间的相互作用力，因此消除了CHS对PE的稳定作用。（2）酸性pH值下，CHS的水溶性下降，而PE的水溶性增强，CHS和PE在水中不相混溶性增加。（3）酸性pH值下，CHS的头基脱水会使其几何形状从圆锥形变为圆柱形，对PE的磷脂双分子层的稳固作用减弱，使PE的表面形态由双层相向六方晶相变化。

本实验根据姜黄素-顺铂两药最佳联用比例（6∶1），采用薄膜分散法制备CCL，期望两药在最佳协同比例条件下能产生较好的抗癌效果。采用HPLC法检测两药含量的过程中，曾参考文献采用Agilent C₁₈反相色谱柱测定2种药物的含量^[22]，在检测过程中发现顺铂出峰时间很快，与溶剂峰不能完全分开，尝试用酸性、碱性流动相后，出峰时间几乎不变，猜测可能是顺铂的极性较大，且C₁₈柱作为固定相，极性是非极性或弱极性，根据同性相吸原理，非极性或弱极性的化合物更容易被色谱柱吸附，而极性大的物质更容易被流动相带走，导致出峰时间提前，后期换为氨基柱对顺铂进行含量测定，目标峰与溶剂峰能分开，最终确定采用氨基柱测定顺铂含量。

对CCL进行表征以及体外抗肿瘤活性评价，CCL的粒径在100～200 nm，能够避免或减少单核巨噬细胞的吞噬，增加其在靶部位的蓄积，进而增加其治疗作用，同时减少对正常细胞的损伤，PDI小于0.3，粒径分布均匀，放置1个月内较稳定，证实CCL符合后期体内药效学评价的iv的条件^[40]。细胞克隆实验的对照组显示，4T1细胞克隆能力较强，后期体内药效学实验种植皮下瘤时，在小鼠体内较容易成瘤^[41]。在细胞划痕实验过程中发现，用不含血清的培养基培养细胞时^[42]，细胞存活时间较短，猜测可能由于癌细胞种类不同，对血清的依赖程度可能也不同，本实验4T1细胞存活时间短的原因可能是不含血清的培养基几乎没有营养，加入药物后，药物对细胞产生了一定的增殖抑制作用，导致细胞快速死亡，后续加入2%血清后，实验可以正常进行。本研究仅对CCL的制备、表征和体外药效学进行评价，后续会对CCL进行体内药效学、组织分布等做进一步研究，为其更深入地开发应用提供完整的实验数据。

综上所述，本研究制备的CCL安全性良好，对4T1细胞的增殖抑制效果较其他组好，有望为药物联用治疗乳腺癌的研究提供思路和依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来源：赵笑雨，陈怡莹，张海亮，唐钧泽，喻锟，潘蕊，程欣．共载姜黄素及顺铂pH敏感脂质体制备及其体外抗乳腺癌活性评价 [J]. 中草药, 2025, 56(1): 52-67.

中草药杂志社

《中草药》荣获＂中国出版政府奖期刊奖＂🌹＂国家期刊奖＂🌹＂中国最具国际影响力学术期刊＂等奖项！🌹🌹