基于全长转录组测序的掌叶大黄GRAS基因家族鉴定

学术 2025-01-28 07:34 天津

GRAS是一类广泛存在于植物体内的转录因子，该家族命名来源于最初确定的3个成员，即gibberellic acid insensitive（GAI）、repressor of GA1-3 mutant（RGA）和scarecrow（SCR）^[1]。GRAS蛋白通常由400～770个氨基酸残基组成，C端序列具有高度同源性，其结构顺序为亮氨酸富集I（LHRI）、VHIID、亮氨酸富集II（LHRII）、PFYRE和SAW基序^[2]。LHRI和LHRII都由2个重复单元（A和B）组成；VHIID可分为3个单元（A、B、C）；PFYRE包含3个不同的部分（P、FY和RE）；SAW由4个单元组成（RVER、W-G、L-W和SAW）。其中VHIID位于LHRI和LHRII两侧，它被证明在蛋白质互作过程中发挥着至关重要的作用；N端是GRAS蛋白执行特定功能的关键部分，由于其长度和序列的高度可变性，它可与各种靶蛋白相互作用，并在植物信号转导过程中充当关键角色^[3]。

GRAS在拟南芥中分为8个亚家族，分别为LISCL、PAT1、SCL3、DELLA、SCR、SHR、LAS和HAM^[4]，而后又新划分了DLT和SCL4/7 2个亚家族，分别参与油菜素内脂的信号通路和环境胁迫的响应^[5-6]。自拟南芥Arabidopsis thaliana L.中发现第1个GRAS基因SCR以来^[7]，GRAS转录因子在植物生长发育、抗生物和非生物胁迫等方面的功能得到了广泛研究。如OsCIGR2通过激活OsHsf23的表达来抑制被病原菌感染的水稻Oryza sativa L.细胞的死亡^[8]。OsGAI能够促进水杨酸（salicylic acid，SA）和茉莉酸（jasmonic acid，JA）介导的防卫信号，多重调控水稻的生长和先天免疫^[9]。在拟南芥中过表达胡杨Populus euphratica Oliv.的GRAS基因PeSCL7，可提高植物抗干旱胁迫的能力^[10]。NtGRAS1在抗霉素A与L-半胱氨酸诱导下能够增加烟草Nicotiana tabacum L.细胞内活性氧含量，从而提高植株抗盐胁迫的能力^[11]。

掌叶大黄Rheum palmatum L.系蓼科大黄属植物，其干燥根及根茎入药及中药大黄，具有下瘀血、血闭寒热、破癥瘕积聚、留饮宿食、荡涤肠胃等功效^[12]。大黄含有蒽醌类、酚类、鞣质、萘苷类、蒽酮类及有机酸等成分，其中，代表性组分蒽醌类具有抗炎、调脂、致泻、止血及抗肿瘤等活性^[13]。鉴于GRAS在植物生长发育及逆境胁迫中的重要作用，现已在水稻Oryza sativa L.^[14]、大麦Hordeum vulgare L.^[15]、葡萄Vitis vinifera L.^[16]等植物中得到系统鉴定，而在药用植物中的研究相对缓慢^[17]，因此本研究利用现有掌叶大黄全长转录组数据，鉴定掌叶大黄GRAS转录因子家族成员并进行表达模式分析，为筛选参与调控大黄生长发育及次生代谢生物合成的候选基因功能研究提供依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

2021年8月在甘肃中医药大学和政药用植物园分别采集样品，经陕西中医药大学胡本祥教授鉴定掌叶大黄R. palmatum L.一年生植株和成熟种子。

1.2 仪器和试剂

茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA，上海源叶科技生物有限公司，批号A25D11L135642）；PrimeScript^TM RT Master Mix反转录试剂盒、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme）；StepOnePlus^TMReal-Time PCR（qPCR）仪（美国Applied Biosystems公司）、K5800型自动检测超微量分光光度计（凯奥公司）。

2 方法

2.1样品的处理

在200 g泥炭土的黑色塑料花盆中点播大小一致的掌叶大黄种子，每盆播4颗，于（23±2）℃，光周期16 h/8 h，光照强度9 000 lx条件下培养。待植株生长至1月龄时挑选长势均匀、生命力旺盛的幼苗3株，随后将根、叶等量混合，使用液氮速冻后，将其置于干冰中送广州基迪奥生物科技有限公司进行全长转录组测序分析。选取3株一年生掌叶大黄的根、根茎和叶各等量混合后进行RNA-Seq分析。对1月龄幼苗喷施200 μmol/L MeJA，以0 h为空白对照，生物学重复3次，分别于3、6、12和24 h处理后取样，用液氮速冻后，置于−80 ℃冰箱保存备用。

2.2 RpGRAS基因家族鉴定及特征分析

掌叶大黄全长转录组数据来源于课题组前期构建^[18]。通过BlastX（http://www.ncbi. nlm.nih.gov/ BLAST/）将isoform序列比对到蛋白数据库Nr（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）、SwissProt（http:// www.expasy.ch/sprot）和KEGG（http://www.genome. jp/kegg），得到与给定Isoform具有最高序列相似性的蛋白，从而得到蛋白功能注释信息。

使用plant TFdb（http://planttfdb.gao-lab.org/ index.php）对预测的蛋白序列进行hmmscan比对，将预测的转录因子归类后，再通过BlastX、ORF Finder在线工具分析筛选具有完整开放阅读框（open reading frame，ORF）的全长GRAS基因。利用ExPASy（https://prosite.expasy.org/prosite.html）验证GRAS蛋白的保守结构域；利用在线网站WoLF PSORT（https://www.genscript.com/wolf-psort.html）、ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）和SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl? page=npsa_sopma.html）分析掌叶大黄GRAS蛋白亚细胞定位、理化性质及二级结构。采用MEME（https://meme-suite.org/meme/tools/ streme）以及TBtools进行保守基序分析。

2.3 RpGRAS基因家族系统进化分析

借助MEGA 7对掌叶大黄、丹参和拟南芥GRAS蛋白进行系统进化分析，采用邻接法（neighbor-joining，NJ），自举值为1 000次。

2.4 基因表达模式分析及实时定量逆转录聚合酶链式反应（real-time quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）验证

基于RNA-Seq数据，筛选出RpGRAS基因在掌叶大黄根、根茎和叶中的表达数据，以FPKM值表示丰度，运用TBtools绘制RpGRAS基因在不同组织中的基因表达热图，分析其在掌叶大黄不同组织部位的表达模式。

参照RN38-EASYspin Plus植物RNA提取试剂盒说明书提取掌叶大黄各样品总RNA，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，K5800超微量分光光度计检测RNA浓度和纯度。使用反转录试剂盒合成cDNA第一链（PrimeScript^TMRT Master Mix）。利用RT-qPCR检测RpGRAS基因响应激素相对表达量，以β-actin为内参基因，RpGRAS基因RT-qPCR引物参考（表1）。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme）进行RT-qPCR，20 μL反应体系：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL、Forward/Reverse primer各0.8 μL、cDNA模板2 μL、50×ROX Reference Dye 0.4 μL、ddH₂O 6 μL。反应程序：预变性95 ℃、30 s，变性95℃、3 s，退火60℃、30 s，延伸60℃、30 s，40个循环，反应结束后于95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s条件下绘制熔解曲线。所有RT-qPCR反应技术重复和实验重复各3次，应用2^−∆∆Ct法计算相对表达量。

2.5 统计学分析

应用SPSS 26软件对RpGRAS基因响应MeJA的表达量进行t检验，P＜0.05代表显著差异。

3 结果与分析

3.1 RpGRAS家族的鉴定和理化性质分析

掌叶大黄全长转录组GRAS家族共有125个isoforms，含完整开放阅读框（open reading frame，ORF）的isoforms有54个，整理ORF差异位点并合并重复，最终得到39个全长GRAS转录因子，重命名为RpGRAS1～RpGRAS39（表2），GenBank登录号为PP084894～PP084932。蛋白氨基酸数目介于244（RpGRAS30）～758（RpGRAS1/31）aa；蛋白质的相对分子质量介于26 341.64（RpGRAS30）～82 263.12（RpGRAS31）；蛋白质理论等电点介于4.86（RpGRAS20）～6.56（RpGRAS4），均为酸性蛋白。除RpGRAS27以外，其余RpGRASs蛋白均属于疏水性蛋白；RpGRAS3/15/28/33/36/39为稳定蛋白，其余为不稳定蛋白。RpGRASs家族蛋白二级结构主要由α螺旋和无规卷曲构成。亚细胞定位预测结果显示39个RpGRASs蛋白定位于细胞核、叶绿体和细胞质，说明RpGRAS成员可在不同的微环境中发挥作用。

3.2 RpGRAS基因进化关系分析

使用MEGA 7软件将前期鉴定得到的掌叶大黄、拟南芥和丹参的GRAS蛋白序列采用NJ构建系统发育树，设置使用默认参数。根据拟南芥和丹参亚家族分类方法，将RpGRAS蛋白聚在其中的6个亚家族，分别是PAT1、DELLA、HAM、SHR、SCR和SCL4/7（图1），而DLT、LAS、SCL3、LISCL亚族中不包含鉴定到的RpGRAS蛋白。系统发育树显示，在6个RpGRAS家族中，PAT1亚家族的成员最多，含有18个成员；其次是DELLA和HAM亚家族，各含有8个成员；SHR亚家族含有3个成员；而SCR和SCL4/7亚家族所含基因最少，均只含有1个成员。

3.3 RpGRAS基因家族保守基序分析

利用在线软件MEME对掌叶大黄39个RpGRAS蛋白序列进行保守基序分析（图2）。结果表明，不同RpGRAS转录因子包含的保守基序数量及种类存在着差异。所有GRAS成员都含有Motif 3、4。Motif 3含有SAW基序且存在于C端末尾，Motif 1、2、4、7、8含有PFYRE基序，可以看出Motif 3、4保守度最高，表明这些基序可能在GRAS家族中发挥着重要作用。Motif 1在HAM和SCR亚族中完全丢失；Motif 1和Motif 6在HAM亚族中完全丢失；Motif 1、2、3、4、5、6、7、9都存在于PAT1亚族。其中，PAT1亚族的RpGRAS29和DELLA的RpGRAS30这2个基因基序缺失严重。结构域分析显示，39个RpGRAS基因均具有GRAS结构域。

3.4 RpGRAS基因家族不同部位表达量

将39个RpGRAS基因在3个部位的差异表达数据进行层级聚类。结果表明（图3），GRAS基因在不同部位差异表达，大多数在根中表达水平偏高，分别有14和11个基因在根和根茎中高表达，其中RpGRAS5、RpGRAS12、RpGRAS16、17在根和根茎中高表达。PAT1、HAM和SHR亚家族的基因在根、根茎和叶中均有表达；DELLA和SCL4/7亚家族主要在根和根茎中高表达，在叶中低表达；SCR在叶和根中高表达，在根茎中低表达。

3.5 MeJA处理下RpGRAS基因的相对表达量

qRT-PCR检测3个GRAS基因在MeJA处理3、6、12、24 h的表达谱。如图4所示，以0 h（CK）为对照，MeJA处理下RpGRAS17和RpGRAS20在24 h内表达上调，呈先上升后下降的趋势，且RpGRAS17在6 h达到峰值，为CK的3.62倍；RpGRAS20在12 h达到峰值，为CK的3.41倍；RpGRAS18在6 h后被显著抑制，并在12 h到达谷值为CK的0.09倍。

4 讨论

GRAS家族是一类重要的植物特异性转录因子，该基因家族成员广泛参与植物生长发育、信号转导和非生物胁迫反应^[19]。本研究通过掌叶大黄全长转录组数据，鉴定到39条全长RpGRAS基因，这与拟南芥^[20]、丹参Salvia miltiorrhiza L.^[21]等植物中鉴定得到的GRAS家族基因数量相近。RpGRAS蛋白主要为不稳定性亲水蛋白，仅RpGRAS3、RpGRAS15、RpGRAS28、RpGRAS33、RpGRAS36、RpGRAS39为稳定性亲水蛋白，这可能是RpGRAS蛋白非保守区域氨基酸存在差异的结果。多序列比对和保守基序分析发现，部分RpGRAS基因缺失Motif，在HAM亚族中仅RpGRAS29缺少LHRI结构域和Motif 1、3、6、7、9，在DELLA亚族中仅RpGRAS30缺少LHRI、VHIID结构域和Motif 2、5、6、7、8、9，因此推测Motif 7、9和Motif 5、8分别为LHRI和VHIID保守结构域的重要组成部分，但这些保守基序的作用还需进一步的研究，以阐明它们在掌叶大黄生长中的潜在功能。

系统进化分析显示RpGRAS蛋白分为6个亚族，同一亚家族成员因其具有相似的保守结构域，可能具有相似功能。SHR和SCR是拟南芥根尖分生活性和根辐射形态的重要转录因子^[22]，RpGRAS27与SCR同源，均为SCR亚族且在根中高表达，暗示RpGRAS27可能在掌叶大黄根部发育中发挥着重要作用；RpGRAS2、RpGRAS5、RpGRAS 7、RpGRAS16、RpGRAS17、RpGRAS19、RpGRAS30、RpGRAS32被归类为DELLA亚族，在根茎中均为高表达，在拟南芥中大部分DELLA亚族的基因已被证实是赤霉素（gibberellins acid，GA）信号通路的抑制因子，其保守的DELLA结构域是GA信号感知所必需的^[23]，因此，推测这些RpGRAS基因在GA信号通路中发挥作用。PAT1亚族广泛参与植物抗逆境胁迫，如葡萄VaPAT1基因在拟南芥中过表达可提高植物抗逆性^[24]；棉花Gossypium hirsutum L.中部分PAT1亚家族的基因响应盐胁迫、干旱胁迫和高低温胁迫^[25]，预测掌叶大黄PAT1亚族基因可能参与非生物胁迫。在拟南芥HAM亚族中HAM、HAM2和HAM3以及HAM4参与维持植物分生组织的自我更新能力^[26]，推测与拟南芥HAM亚族聚类的RpGRAS1、RpGRAS3、RpGRAS10、RpGRAS15、RpGRAS29、RpGRAS31、RpGRAS33、RpGRAS36可能在掌叶大黄中也有相似的功能。

GRAS基因在植物生长发育及生物合成中的作用可以通过它们在激素信号通路中的作用表现出来，而MeJA等植物激素在增强植物对生物和非生物胁迫的防御反应中也扮演关键角色^[27]。如御谷Pennisetum americarum PgGRAS46在干旱胁迫下经MeJA处理后表达上调^[28]；GhSCL13-2A通过介导JA等信号通路和活性氧的积累，正向调节棉花对棉花黄萎病菌的抗性^[29]；VaPAT1可通过调节JA生物合成从而在葡萄抗寒应激反应中起关键作用^[30]。在拟南芥中，增强JA信号可促进与JA负调控因子（jasmonate ZIM-domain，JAZ）蛋白结合的DELLA蛋白游离，从而调控下游PIF3转录因子，抑制下胚轴伸长^[31]。DELLA蛋白RpGRAS17、PAT1蛋白RpGRAS18和RpGRAS20在MeJA处理下基因表达显著上调，RpGRAS17、RpGRAS18在6 h时到达峰值，RpGRAS20在12 h时到达峰值。推测这些基因可能参与JA信号转导，从而在掌叶大黄生长发育及抗逆反应中起到调控作用。此外，在拟南芥中，DELLA被证明促进花青素的积累^[32]，还参与黄酮醇生物合成调控^[33]。因此，响应MeJA的RpGRASs基因可能在掌叶大黄生长发育、抗逆及次生代谢物生物合成中发挥功能，其分子功能有待于进一步深入研究。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来源：杜桥，唐璟，李依民，张明英，高静，彭亮，冯昭，张岗．基于全长转录组测序的掌叶大黄GRAS基因家族鉴定 [J]. 中草药, 2024, 56(2): 617-625.

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