整合16S rRNA测序技术和代谢组学探究白鲜皮对斑马鱼幼鱼的肝毒性机制

学术 2025-01-14 07:31 天津

白鲜皮为芸香科植物白鲜Dictamnus dasycarpus Turcz. 的干燥根皮，又称羊鲜草，主产于我国辽宁、河北等地区，其味苦，性寒，归脾、胃、膀胱经，具有清热燥湿、祛风解毒的功效，可用于治疗湿热疮毒、湿疹疥癣、黄疸及湿热引起的痹痛等证^[1]。白鲜皮中含有生物碱、柠檬苦素、黄酮及苯丙素类化学成分，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用，临床主要用于治疗皮肤炎症、湿疹、风疹、风湿、妇科炎症等，具有丰富的药用价值^[2-7]。然而，查阅白鲜皮毒性研究方面的文献发现^[8]，白鲜皮相关制剂复方如克银丸、痔血胶囊、青黛丸等会导致肝损伤。研究发现，小鼠ig白鲜皮醇提物（60 g/kg）可导致肝细胞严重坏死，且具有剂量和时间相关性^[9]。给予小鼠白鲜皮水煎剂后发现小鼠血清中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量大幅度上升且肝脏组织出现大面积损伤^[10]；通过网络药理学实验和动物体内实验探究白鲜皮的肝毒性，小鼠ig白鲜皮（92.7 g/kg）7 d后，肝组织病理出现重度出血，大量肝细胞出现坏死，且出现肝纤维化，同时小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）等指标水平显著上升^[11]；免疫特异质肝损伤评价模型结果显示，在免疫应激状态下白鲜皮水提物和醇提物会诱导免疫炎症反应的发生，且白鲜皮水提物能显著促进白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等炎症因子的表达^[12]；通过斑马鱼幼鱼探究白鲜皮中有效成分白鲜碱的肝毒性，结果显示，给予斑马鱼幼鱼10%致死浓度（sublethal concentration，LC₁₀）后，斑马鱼幼鱼肝功能指标AST、ALT等受到影响，苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）、油红O及吖啶橙（acridine orange，OA）染色实验显示斑马鱼幼鱼肝组织出现损伤^[13]。以上研究均表明白鲜皮可对肝脏产生一定的损伤和毒性。

肠道菌群对健康有广泛的影响，从预防疾病、改善免疫系统到肠道健康，它在维持整体健康方面发挥着重要作用^[14]。药物经口服后与肠道中的微生物相互作用，已有研究表明，肝脏是暴露于肠道微生物代谢物的主要器官，肠道菌群与肝脏健康密切相关，通过肠-肝轴，肠道菌群的变化会引起肝脏炎症、氧化应激等损伤^[15]，因此可以利用肠道微生物来研究药物产生的肝毒性。代谢组学是通过代谢物分析了解生物系统和预测其行为的重要科学，代谢组学不仅可以用来解释物种之间的相互作用机制，还可以探索具有生物活性的代谢物。因此，代谢组学技术已被广泛应用于肝毒性研究^[16-17]。

本研究基于16S rRNA测序技术和非靶向代谢组学方法，基于斑马鱼幼鱼模型，多层次、多角度、多指标探讨白鲜皮在斑马鱼幼鱼中的肝毒性机制，寻找与肝毒性相关的微生物菌群和生物标志物及代谢通路，探究白鲜皮肝毒性机制，为斑马鱼在中药肝毒性评价中的适用性提供支持，为白鲜皮诱导肝毒性的分子机制提供了科学依据，同时，为白鲜皮在临床用药安全有效提供参考。

1 材料

1.1 动物

受精4 d后（4 days after fertilization，4dpf）野生型AB品系斑马鱼购于杭州环特生物科技股份有限公司，动物许可证号SCXK（浙）2022-0003，饲养于（28.0±0.5）℃、pH为（7.0±0.5）的培养水（1 L反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率为450～550 s/cm；pH为6.5～8.5；硬度为50～100 mg/L CaCO₃）中，每日更换培养水，采用自然光照/黑暗14 h/10 h的周期，每日按时投喂斑马鱼幼鱼饲料2次。本研究动物实验已通过杭州环特生物科技股份有限公司实验动物管理与使用委员会审查（伦理号IACUC-2024-8718-01）。

1.2 药品与试剂

白鲜皮药材（批号230425001）购自于河北全泰药业有限公司，经黑龙江中医药大学药学院中药植物教研室南洋教授鉴定为芸香科植物白鲜D. dasycarpus Turcz.的干燥根皮。取白鲜皮生药300 g放入水中浸泡30 min，加入8倍水回流提取2次，每次30 min，滤过2～3次，合并滤液，将浓缩后的浸膏冻干成粉末，4 ℃保存备用，通过HPLC进行含量测定。

甲醇（批号50102）购自北京迪马欧泰科技发展中心；丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、超氧化物歧化酶（superoxide Dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、层黏连蛋白（laminin，LN）、谷胱甘肽（glutamate，GLU）试剂盒（批号均为202308）均购自江苏晶美生物科技有限公司；斑马鱼培养液（批号2303005）购自上海费曦生物科技有限公司；OA染液（批号0327A23）购自深圳希宝生物科技有限公司；对照品白鲜碱（质量分数98%，批号111654-200602）购自中国食品药品检定研究院；黄柏酮（质量分数98%，批号111923-202105）、梣酮（质量分数98%，批号111700-202004）均购自中国食品药品检定研究院；4%多聚甲醛组织固定液（批号P0099）购自上海碧云天生物技术有限公司；HE染色液（批号BA4025）购自珠海贝索生物技术有限公司。

1.3 仪器

Waters 2695-2489型HPLC超高效液相色谱仪（美国Waters公司）、Acquity THUPLC型超高液相色谱与Q-TOF-MS质谱仪（美国Waters公司）；Waters BEH C₁₈柱（美国Waters公司）；FRESCO17型低温高速离心机、超低温冰箱、M2000Pro型酶标分析仪（美国赛默飞世尔科技有限公司）；FA2004型电子天平（中国天马股份有限公司）；Gamma1-16型冻干机（德国marinchrist公司）。

2 方法

2.1 白鲜皮中指标成分含量测定

2.1.1对照品溶液的制备取白鲜碱、梣酮、黄柏酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成含白鲜碱15 μg/mL、梣酮60 μg/mL、黄柏酮0.1 mg/mL质量浓度的混合对照品溶液，按照外标法计算白鲜碱、梣酮和黄柏酮的含量^[18]。

2.1.2 供试品溶液的制备取白鲜皮粗粉（过4号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.3色谱条件采用Waters Symmetry C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（60∶40），等度洗脱30 min；检测波长236 nm；进样体积10 μL；体积流量1 mL/min；柱温35 ℃。

2.2 LC₁₀的测定

随机选取受精后4 dpf的斑马鱼幼鱼置于6孔板中，20尾/孔，分别给予白鲜皮的质量浓度为100、200、300、400、500、600、700、800、1 000 μg/mL的培养水，以斑马鱼培养水为对照组，每组4个复孔。28 ℃处理24 h，其间每日统计各质量浓度白鲜皮组斑马鱼死亡的数量，24 h后统计每组的死亡率，并计算LC₁₀。

死亡率＝斑马鱼死亡个数/斑马鱼总数

2.3 斑马鱼幼鱼肝脏组织结构评价

随机选取4 dpf斑马鱼幼鱼暴露于亚致死浓度（＜LC₁₀，100、300、500 μg/mL）的白鲜皮药液中，同时设置对照组（斑马鱼培养水），24 h后用斑马鱼培养水清洗3次，将斑马鱼幼鱼置于离心管内，加入4%多聚甲醛固定24 h，进行HE染色，切片，在显微镜下观察拍照。

2.4 斑马鱼幼鱼体内细胞凋亡评价

给药、分组同“2.3”项下方法，24 h后，用斑马鱼培养水清洗3次，使用5 µg/mL吖啶橙染液对各组的幼鱼进行避光染色 20 min，用斑马鱼培养水清洗幼鱼3次，于荧光显微镜下观并拍照。

2.5 斑马鱼肝脏生化指标检测

给药、分组同“2.3”项下方法，24 h后，用斑马鱼培养水清洗3次，每组收集100尾幼鱼样本，于PBS（1∶9）中匀浆，2 500 r/min离心10 min，取上清液，按照试剂盒说明书测定ALT、AST、LN、ALB、GLU、MDA和SOD的活性。

2.6 16S rRNA高通量测序

2.6.1样本采集和DNA提取各组选取3条斑马鱼幼鱼样本，采用十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）提取样本DNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，选取所需的区域为测序序列，等量混样后使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和RT-qPCR定量，文库合格后，使用NovaSeq6000进行上机测序。

2.6.2测序数据分析处理使用fastp软件对原始碱基序列进行过滤得到高质量reads，Tags序列通过vsearch与物种注释数据库进行比对检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据，接着对各样本的有效数据根据97%序列相似性原则，进行操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）聚类，并对OTU的序列进行物种注释。

2.7 代谢组学分析

2.7.1 样品处理随机选取4 dpf斑马鱼幼鱼暴露于白鲜皮高剂量药液中作为白鲜皮组，同时设置对照组（斑马鱼培养水），24 h后将各组幼鱼在预冷的甲醇溶液中匀浆，4 ℃、13 500 r/min离心20 min，取上清，进样检测。

2.7.2色谱条件采用C₁₈色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为0.05%甲酸乙腈溶液（A）-0.05%甲酸水溶液（B）；梯度洗脱程序为0～8 min，98%～60% B；8～10 min，60%～2% B；10～13 min，2%～0% B；13～14 min，0%～98% B；14～17 min，98%～98% B；体积流量0.40 mL/min，进样体积2 μL，柱温为0 ℃，样品仓温度5 ℃。

2.7.3 质谱条件样品经UHPLC分离后，使用AB·SCIEX质谱仪电喷雾电离（ESI）正、负离子模式进行分析。ESI源参数Gas1和Gas2均60 psi（1 psi＝6.895 kPa），气帘气（CUR）30 psi，离子源温度110 ℃，喷雾电压（ISVF）±5 500 V。一级质荷比检测范围m/z 60～1 000，二级质荷比检测范围m/z 25～1 000，一级质谱扫描累积时间0.20 s，二级质谱扫描累积时间0.05 s。二级质谱采用数据依赖型采集（IDA），并通过峰强度筛选。去簇电压（DP）±60 V，碰撞能量设置为（35±15）eV，IDA动态排除同位素离子范围m/z 4，每次扫描采集10个碎片图谱。

2.7.4数据分析质谱数据通过UNIFI软件自动输出到Progenesis QI软件中，进行数据基线过滤和校准、峰提取、峰校准、峰识别和归一化等一系列预处理采用主成分分析（principal component analysis，PCA）进行无监督的统计分析，再采用有监督的偏最小二乘法-判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）将待测样品进行分组分析，得出相应的得分图。为了避免PLS-DA模型出现过度拟合的情况，应使用SIMCA-P 12.0软件进行默认的交叉验证，并使用200次的随机排列对数据进行测试。绘制反映组间离散度的S-plot和变量重要性投射VIP-plot，结合各离子聚集点的各组之间的偏离变化趋势，根据得分图筛选特征性代谢产物，在同一标准下鉴定出具有明显差异性的表达代谢物。

2.7.5差异代谢物筛选及代谢通路富集分析以变量投影重要性（importance of variable projection，VIP）＞1、P＜0.05筛选潜在的生物标志物。通过标志物的精确相对分子质量，在人类代谢物数据库（human metabolome database，HMDB）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）数据库中检索，确定差异性代谢物。导入MetaboAnalyst 5.0网站对鉴别的差异代谢物进行代谢通路富集和分析，研究分析其生物标志物的代谢途径，进行代谢通路分析。

2.8 统计学分析

采用Graphpad Pism9.5软件进行统计学处理，各项指标结果均以表示，对定量数据进行正态性检验，P＞0.05为正态分布，反之为偏态分布。正态分布采用t检验，偏态分布采用秩和检验，组间比较采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 白鲜皮中指标成分的含量测定

混合对照品溶液及白鲜皮供试品溶液的HPLC色谱图，见图1。白鲜碱质量分数为0.43 mg/g，黄柏酮质量分数为4.12 mg/g，梣酮质量分数为1.36 mg/g。

3.2 白鲜皮对斑马鱼幼鱼的LC₁₀

经SPSS 25.0中的回归分析计算，白鲜皮对斑马鱼幼鱼的LC₁₀为572.43 μg/mL。

3.3 对斑马鱼幼鱼肝脏组织结构的影响

通过观察斑马鱼病理切片（图2），结果表明，对照组斑马鱼肝脏组织细胞完整、细胞质均匀，细胞核呈规则圆形；而经白鲜皮暴露处理后的斑马鱼肝脏组织明显损伤，可见组织结构紊乱、细胞质减少、排列松散、空泡化严重。

3.4 对斑马鱼幼鱼体内细胞凋亡的影响

吖啶橙可以透过细胞膜与凋亡细胞内的DNA结合，在荧光显微镜下发出绿色荧光^[19]。与对照组比较，白鲜皮LC₁₀下暴露处理后斑马鱼肝脏区域荧光明显增强、细胞凋亡增多，表明白鲜皮能够诱导斑马鱼肝脏损伤，显著引起肝细胞凋亡，并呈剂量相关，见图2。

3.5 对斑马鱼肝脏生化指标的影响

如表1所示，与对照组比较，白鲜皮给药24 h后，ALB、SOD含量随给药浓度增加显著下降（P＜0.05、0.01），AST、ALT、LN、GLU、MDA含量随给药浓度增加显著升高（P＜0.05、0.01）。

3.6 对斑马鱼幼鱼肠道菌群的影响

3.6.1 α多样性分析 α多样性分析用于分析样本内的微生物群落多样性，可以反映样本内的微生物群落的丰富度和多样性^[20]。如图3-A所示，与对照组比较，白鲜皮组扩增子序列变体（amplicon sequence variant，ASV）、Shannon、Chao1、Simpson指数均显著下降（P＜0.05、0.01、0.001）。稀释曲线可直接反映测序数据量的合理性，并间接反映样本中物种的丰富程度，当曲线趋向平坦时，说明测序数据量渐进合理。图3-B表明，2组样本的稀释曲线呈现相似的趋势，即急速上升然后趋于平缓，表明测序深度较好，所得测序结果可以反映当前样本中所包含物种的多样性。物种的丰富度由曲线的宽度来反映，物种的丰富度越高，曲线在横轴上的跨度越大^[21]。图3-C表明，对照组曲线宽度明显大于白鲜皮组，进一步说明白鲜皮能降低肠道菌群的丰富度和均匀度。

3.6.2 β多样性分析 β多样性分析是对不同样本的微生物群落构成进行比较分析，本研究基于Weighted Unifrac距离和Bray-Curtis距离结合PCoA分析，一般来说群落差异很大的样本距离越远。结果发现对照组内数据集中，与白鲜皮暴露组距离较远，分散性良好。与对照组比较，白鲜皮暴露组菌群结构发生变化，表明白鲜皮改变了斑马鱼幼鱼肠道菌群的结构，见图4-A、B。

3.6.3 物种差异与标志物种分析对斑马鱼幼鱼肠道组织的16S rRNA基因测序结果进行物种组成分析，结果如图4-C所示，对照组和白鲜皮组在门水平和属水平上的群落结构和相对丰度。斑马鱼幼鱼肠道组织中的肠道菌群主要分属变形菌门，其次是拟杆菌门和厚壁菌门，广古菌门和蓝藻门所占比例较低；在属水平上，斑马鱼幼鱼肠道组织中的肠道菌群主要分布于丛毛单胞菌属，其次是金黄杆菌属和鞘氨醇杆菌属，普拉梭菌属占比较低。

选取所有样本中定量值之和排名前35的微生物分类，根据其在每个样本中的定量信息，从物种和样本2个层面进行聚类，绘制成热图（图4-D）；通过OPLS-DA分析结果展示了2组之间的差异（图4-E）。

线性判别分析（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）可以用于进行2个或多个分组的比较，能够在组与组之间寻找具有统计学差异的生物标志物，展示了白鲜皮暴露处理后肠道菌群中主要的显著差异标志物，见图4-F、G。

在门水平上，与对照组比较，白鲜皮组变形菌门、衣原体门、异常球菌-栖热菌门和疣微菌门含量显著升高（P＜0.05、0.001），而拟杆菌门含量显著降低（P＜0.01）；在属水平上，不动杆菌属、异常球菌属、丛毛单胞菌属以及埃希氏菌属含量明显上升（P＜0.001），而普拉梭菌属含量显著降低（P＜0.05），结果见图5。

3.6.4 代谢通路差异分析利用PICRUSt2生物信息软件包预测16S rRNA基因序列在KEGG数据库的功能预测，共发现43条KEGG二级通路，如图6所示，其中位于最显著富集前5位分别为氨基酸代谢、碳水化合物代谢、能量代谢、辅因子和维生素的代谢和膜运输。结果表明，白鲜皮干预斑马鱼幼鱼能够改变斑马鱼肠道菌群，其作用机制可能涉及氨基酸代谢途径。

3.7 代谢组学分析

3.7.1 代谢组学轮廓分析 PCA结果表明，在正负离子模式扫描下，2组样本显著分离，说明白鲜皮使斑马鱼幼鱼的机体代谢产生了变化，见图7-A、B。采用OPLS-DA寻找组间差别，斑马鱼体内代谢谱呈现出各自聚类，它们位于散点评分的3个不同区域，各组代谢轨迹相似性好、重叠少、彼此相距较远，表明白鲜皮处理后斑马鱼体内发生了显著的生物学变化。通过200次置换检验对模型进行验证，如图7-C、D所示，正负离子模式下，R²和Q²分别低于最右的原值，且Q²与Y轴相交于负半轴，表明该模型没有过拟合且预测能力良好。观察S-plot图可知，大多数代谢产物离子在原点周围聚集，偏离原点的离子占少数，这些偏离原点的离子说明2组之间存在差异，见图7-E、F。

3.7.2 潜在生物标志物的筛选共筛选鉴定出32个可能的差异代谢物，有21种代谢物表达上调，有11种代谢物表达下调。其中，与对照组比较花生四烯酸、二十碳五烯酸、烟酸、鸟嘌呤等代谢水平上调；磷酸盐、果聚糖、肌苷酸、GLU等代谢水平下调；溶血磷脂酰胆碱种类较多，既有上调趋势也有下调趋势。在层次聚类分析得到标志物热图中，不同位置的色块表示相应位置标志物的相对表达量。从热图中能够直观看出各组之间潜在生物标志物的含量变化，也可以清楚地区分对照组和白鲜皮组的潜在生物标志物含量，差异代谢物层次聚类热图显示对照组、白鲜皮组代谢物在负离子模式和正离子模式下的改变见图8。

3.7.3 代谢通路分析将差异代谢物HMDB号导入MetaboAnalyst 5.0数据库进行代谢通路分析，通过P＜0.05或Impact＞0筛选出潜在的代谢通路，分别为鞘脂代谢、嘌呤代谢、花生四烯酸代谢、半乳糖代谢、GLU代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、药物代谢-细胞色素P450以及不饱和脂肪酸的生物合成，见图9。其中，嘌呤代谢在白鲜皮给药产生毒性的过程中−logP值最大，即相关性最强；花生四烯酸代谢Impact值最大，说明显著影响性最大。

3.8 肠道菌群和代谢组学的相关性分析

为进一步探究肠道菌群与差异代谢产物的复杂关系，对门和属水平的优势菌群与差异代谢产物进行了相关性分析。拟杆菌与肝脏花生四烯酸代谢物呈负相关，肝脏花生四烯酸代谢物的增加与肠道菌群拟杆菌丰度的减少有关；变形菌与肝脏花生四烯酸代谢物呈正相关，肝脏花生四烯酸代谢物的增加与变形菌丰度的增加有关。拟杆菌与GLU代谢呈正相关，与细胞色素P450酶代谢呈负相关，变形菌与不动杆菌与GLU代谢呈负相关，与细胞色素P450酶代谢呈正相关，给予白鲜皮处理后，白鲜皮组的花生四烯酸代谢物显示拟杆菌显著减少，变形菌显著增加，GLU代谢物显示拟杆菌显著减少，变形菌与不动杆菌显著增加，细胞色素P450酶代谢代谢物显示拟杆菌显著减少，变形菌与不动杆菌显著增加，见图10。

4 讨论

近年来，临床上使用中药治疗疾病的频率越来越高，中医药的疗效逐步获得广泛认可，但一些中草药在临床使用或研究中发现具有肝毒性的报道越来越多^[22-24]。白鲜皮一直被用于治疗皮肤性疾病，具有抗炎、抗过敏、抗菌等多种药理作用。现代药理学研究发现，白鲜皮会导致不同程度的肝损伤的出现。白鲜碱、梣酮、黄柏酮为白鲜皮主要药效成分，白鲜碱可能通过致小鼠肝脏DNA高基甲化上调肝分解的外源性药物等导致肝损伤^[25]。研究表明，ALT和AST可用于评价肝脏功能和肝损伤，当肝细胞损伤时细胞内的转氨酶将释放到血浆中，使其含量升高^[26]；ALB主要由肝脏合成，当其含量降低时可能说明肝脏合成功能障碍^[27]；LN能反映肝脏病变程度，正常情况下LN含量较低，如果肝脏发生损伤如肝纤维化则LN含量会明显上升^[28]；MDA、SOD为评价氧化应激的指标^[29]；肝细胞线粒体损伤时GLU活性显著升高，是肝实质损害的敏感指标^[30]。本研究结果显示，白鲜皮显著上调斑马鱼幼鱼的ALT、AST、GLU、LN、MDA水平，下调ALB和SOD水平。

宿主微生物群的紊乱与疾病有紧密联系，肠道菌群的紊乱会导致组织损伤和免疫反应加剧，因此肠道菌群的丰度和构成比例变化与机体生理病理状态密切相关。研究表明，肝损伤动物肠道中拟杆菌、梭状菌的丰度降低，普雷沃氏菌、肠埃希菌等的丰度增加^[31]。拟杆菌是肠道菌群稳定的标志之一，拟杆菌能增加抗炎细胞因子IL-10的表达并抑制促炎相关的TNF-α和IL-6的表达来抑制炎症进程^[32]。普雷沃氏菌丰度的增加会促进炎性物质在肠道中的转移^[33]。衣原体门是一类原核细胞型微生物，机体被衣原体感染后会释放炎症因子产生炎症反应加重肝组织损伤^[34]。普拉梭菌是人类肠道菌群

中最重要的细菌之一，具有抗炎作用，维持细菌酶的活性，保护消化系统免受肠道病原体的侵害，属于有益菌^[35]。有研究表明，将普拉梭菌给予患类风湿性关节炎小鼠模型7周，可明显改善关节炎损伤，抑制促炎因子的分泌^[36]。此外，普拉梭菌还能通过调节肠黏膜屏障功能和免疫学特征来抑制炎症反应^[37]，因此，肠道微生物群在肝损伤的发生发展中起着关键作用。近年来，肠道菌群广泛用于研究肝损伤中。研究表明，经白鲜皮-苦参给药后大鼠的肠道菌群紊乱，厚壁菌门/拟杆菌门的值下降，普雷沃氏菌属比例上升，白鲜皮-苦参通过脂质代谢造成肝损伤是其潜在机制^[38]。本研究结果表明，白鲜皮诱导变形菌门、衣原体门的相对丰度增加，拟杆菌门丰度降低。在属水平上，与空白组相比不动杆菌属、埃希氏菌属普雷沃氏菌属的丰度上升，普拉梭菌丰度下降。结合本研究中斑马鱼生化指标ALT、AST含量升高，推测白鲜皮促进炎症反应是致肝毒性机制之一。

本研究基于代谢组学技术筛选出白鲜皮可能导致斑马鱼幼鱼肝毒性代谢通路可能与鞘脂代谢、嘌呤代谢、花生四烯酸代谢、细胞色素P450酶代谢和GLU代谢等途径相关。花生四烯酸（arachidonic acid，AA）通常指全顺式-5,8,11,14-二十碳四烯酸，为1种omega-6多不饱和脂肪酸，由20个碳链和4个顺式双链组成。研究发现，AA代谢物产生的主要部位以及作用的靶器官均为肝脏组织，AA代谢与炎症反应密切相关，AA主要通过环氧合酶（cyclooxygenase，COX）和脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）途径代谢，这2条途径都会促进炎症细胞因子的表达。正常情况下，AA会以磷脂的形式存在，在受到外来刺激时，AA被COX催化激活，代谢产生大量炎症介质如前列腺素、白三烯、血栓素等；也会通过5-LOX的催化氧化等一系列反应生成白三烯A4（leukotrieneA4，LTA4），LTA4在其水解酶的作用下最终生成LTB4。此外，IL-6、IL-12以及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量也会随AA代谢产生^[39-42]，其中TNF-α由巨噬细胞产生，具有促炎作用，持续大量的TNF-α会加速肝脏细胞凋亡^[43]。实验结果显示白鲜皮给药使斑马鱼幼鱼体内的花生四烯酸及LTB4含量增多，它们是花生四烯酸代谢通路的重要组成，与生化指标检测结果结合表明白鲜皮可能通过促进AA代谢导致炎症因子的释放或促进细胞凋亡致肝毒性。

嘌呤作为生物体内的重要碱基能为生物合成提供能量，嘌呤代谢的全过程主要在肝脏中进行，次黄嘌呤氧化生成黄嘌呤。次黄嘌呤可以通过腺嘌呤脱氨酶或亚硝酸的作用由腺嘌呤脱氨生成，也能通过核苷磷酸化酶使肌苷发生磷酸解而生成，通过黄嘌呤氧化酶可被氧化成尿酸后排出体外。次黄嘌呤在氧化过程中除了产生黄嘌呤外还能释放活性氧（reactive oxygen species，ROS），而ROS是氧化应激反应的基础，并且肝脏是一个特别暴露于活性氧的器官，因此嘌呤代谢的异常与肝损伤有密切联系^[44-47]。研究结果显示与空白组相比，白鲜皮给药后斑马鱼幼鱼代谢产物次黄嘌呤含量下降，再结合生化指标MDA与SOD检测结果，说明斑马鱼幼鱼体内的次黄嘌呤大部分都经氧化应激反应同时释放了ROS，次黄嘌呤被大量氧化释放氧自由基，这一结果表明白鲜皮通过嘌呤代谢促进氧化应激反应可能是其肝毒性机制之一。

细胞色素P450酶代谢大量外源性物质，这可能导致肝毒性化合物的形成。药物经细胞色素P450酶代谢过程中产生的亲电性代谢产物能迅速与肝脏功能性蛋白质上富含电子的亲核性基团发生共价结合能破坏肝脏的正常生理功能致肝毒性^[48]，并消耗GLU，结合代谢组学结果，白鲜皮下调斑马鱼幼鱼体内GLU水平，上调细胞色素P450中的N-去甲基西酞普兰，说明白鲜皮肝毒性的机制与代谢激活产生的亲电性反应代谢物有关。

此外，对肠道菌群与差异标志物之间关系的分析表明，变形菌、拟杆菌、不动杆菌水平与AA、GLU、细胞色素P450代谢直接相关。同时，白鲜皮紊乱肠道菌群组成的稳定性进而促进炎症反应、氧化应激反应和代谢激活过程可能是白鲜皮干造成肝毒性的潜在机制。本研究后续会对斑马鱼幼鱼体内炎症因子、氧化应激指标和细胞色素P450进行定量分析及相关研究，进一步确定肠道菌群与差异代谢物之间的关系，以期丰富白鲜皮的毒性机制。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来源：沃佳美雪，徐晓敏，贾素霞，胡文凯，卢芳，刘树民．整合16S rRNA测序技术和代谢组学探究白鲜皮对斑马鱼幼鱼的肝毒性机制 [J]. 中草药, 2025, 56(1): 177-190.

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