基于网络药理学与分子对接探讨钩吻素甲对舌鳞状细胞癌增殖与凋亡的影响

学术 2025-01-18 09:06 天津

舌鳞状细胞癌（TSCC）作为一种常见的口腔癌类型，约占口腔癌病例总数的25%～40%^[1]，目前TSCC的主要治疗手段有手术治疗、放疗、化疗等，但TSCC患者的5年生存率不足50%，药物耐受是导致TSCC预后不佳的常见原因之一^[2]。因此，开发安全有效的药物，是目前治疗TSCC的紧迫任务。

钩吻Gelsemium elegan Benth.为马钱科胡蔓藤属植物，又名断肠草、胡蔓藤、大茶药等^[3]，具有良好的抗肿瘤、镇痛、调节免疫功能等多种作用^[4]，本课题组前期研究表明，钩吻总碱对人肺腺癌A549、SPCA1、人舌鳞癌CAL27等多株癌细胞具有抑制作用^[5]。钩吻素甲（GEL）是钩吻的有效单体成分之一，具有含量高、毒性低^[6-7]的特点，已有研究表明GEL对肝癌、结肠癌等肿瘤细胞具有抑制作用^{[3, 8]}。本研究通过网络药理学方法预测GEL抗TSCC的相关靶点，并将核心靶点与GEL进行分子对接，进一步应用GEL干预人舌鳞癌CAL27细胞以验证其作用机制，旨在为GEL抗TSCC提供理论与实验依据。

1 材料

1.1 细胞与药物

人舌鳞癌CAL27细胞由本实验室保存，GEL（购自上海陶术科技有限公司，批号T5S0662，质量分数：99.81%）。

1.2 试剂

DMEM培养液（购自Gibco公司，批号8122600）；胎牛血清（购自TransSerum公司，批号FS201-02）；二甲基亚砜（DMSO，购自MP Biomedicals公司）；Hoechst 33258、Rhodamine 123、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、增强型细胞增殖与活性检测-8（CCK-8）试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、极超敏ECL化学发光试剂盒（购自上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为C1018、C2007、C1052、C0043、P0012A、P0018FS）；Bax、Bcl-2、Caspase-3/p17/p19、GAPDH多克隆抗体（批号分别为50599-2-Ig、12789-1-AP、19677-1-AP、60004-1-Ig；购自武汉三鹰生物技术有限公司）。

1.3 仪器

Incucyte S3活细胞动态功能分析系统（美国Sartorius公司）；BD FACSVia全自动激光四色流式细胞仪（美国BD公司）；UVP Chem Studio 815近红外双色荧光成像系统（德国耶拿公司）；SYNERGY H1M多功能酶标仪（美国BioTek公司）；MP Tetra CellMini蛋白电泳系统(美国伯乐公司)；ACB-4E1超净工作台（新加坡Esco公司）；CCL-240B-8二氧化碳培养箱（新加坡Esco公司）；CKX53荧光倒置显微镜（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 网络药理学与分子对接^[9]

2.1.1 药物-疾病共同靶点筛选通过检索PubChem数据库，输入“gelsemine”获取GEL的分子结构及Canonical SMILES，使用SwissTargetPrediction和Pharmmapper网站，预测GEL的作用靶点。通过检索GeneCards数据库和OMIM数据库，输入“Tongue squamous cell carcinoma”，将物种设定为“Homo sapiens”，以Relevance score≥50为条件，筛选GeneCards数据库的数据，汇总并删除重复基因得到TSCC的相关靶点，使用Venny 2.1.0在线绘图工具绘制Venn图得到交集靶点。

2.1.2 构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络模型并筛选核心靶点把交集靶点导入STRING数据库中，设定物种为“Homo sapiens”，置信度设为 “medium confidence”（＞0.400），分析交集靶点并构建其PPI网络模型。下载TSV数据，而后使用Cytoscape 3.10.1软件将进行数据分析，绘制PPI网络图，并使用插件Cytohubba中MCC算法生成的数值为依据，排名前10名为核心靶点。

2.1.3 基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析把交集靶点导入Metascape数据库，设定物种为“Homo Sapiens”。在GO数据库中分别进行生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞成分（CC）分析，而后使用KEGG进行通路分析。利用微生信平台在线绘制技术，对分析结果进行可视化展示。

2.1.4 药物-关键靶点分子对接在Pubchem数据库搜索GEL的3D结构信息，然后使用OpenBabel 3.0软件转化为pdb格式。从PDB数据库下载核心靶点蛋白质3D结构，通过PyMOL软件删除水分子和小分子配体，使用AutoDock Vina软件进行分子对接，使用 PyMOL软件对结果进行可视化分析。

2.2 细胞实验

2.2.1 药物配制精密称取20 mg GEL粉末，在超净台中用0.5 mL无菌DMSO完全溶解，加入4.5 mL DMEM完全培养基混匀，得4 000 μg·mL⁻¹（含10% DMSO）的GEL母液，经0.22 μm滤膜除菌后，每2 mL GEL母液混合18 mL DMEM完全培养基，得400 μg·mL⁻¹（含1% DMSO）的GEL溶液，4 ℃保存备用。给药时，添加DMEM完全培养基稀释400 μg·mL⁻¹的GEL溶液至相应浓度药液，DMSO终体积分数均小于1%。

2.2.2 细胞培养人舌鳞癌CAL27细胞培养于含有10% FBS、1%青链霉素混合液的DMEM完全培养基，并置于37 ℃、含5% CO₂湿润空气的培养箱培养，每24 h换液1次，细胞生长至融合度达80%时进行传代处理。

2.2.3 活细胞动态分析取对数生长期细胞，将细胞悬液浓度调整至1×10⁵个·mL⁻¹，取100 μL悬液均匀接种于96孔板，培养24 h细胞贴壁后设置9个质量浓度GEL（0、50、100、150、200、250、300、350、400 μg·mL⁻¹）进行药物干预，每个质量浓度重复3次。加药后置于活细胞动态分析仪监测48 h，根据干预48 h的细胞融合度绘制融合度曲线图，并拟合半数抑制浓度（IC₅₀）值。

2.2.4 分组及给药以GEL作用CAL27细胞48 h的IC₅₀值为依据，设置GEL低、中、高3个质量浓度（150、250、350 μg·mL⁻¹）组处理人舌鳞癌CAL27细胞，并以完全培养基处理作为对照组。接种CAL27细胞于96孔板或6孔板，细胞贴壁后按实验设置分组给药干预24 h或48 h。

2.2.5 CCK-8实验取对数生长期细胞，以1×10⁵个·mL⁻¹细胞密度接种于96孔板，每孔100 μL，每组重复3次，培养24 h细胞贴壁后，按“2.2.4”项下方法进行分组给药，分别干预24 h或48 h后吸弃上清，加入100 μL的1×CCK-8溶液（90% DMEM＋10% CCK-8溶液），置于37 ℃培养箱孵育1 h，使用酶标仪在450 nm波长处检测吸光度（A）值。

增殖抑制率＝[1－（A_实验－A_背景）/（A_对照－A_背景）]

2.2.6 克隆形成实验取对数生长期细胞，以1×10³个·mL⁻¹细胞密度接种于12孔板，每孔1 mL，每组设3个重复。培养24 h细胞贴壁后按“2.2.4”项下方法进行分组给药干预48 h，弃含药培养基，加入完全培养基继续培养7 d，染色时吸除旧培养液，PBS清洗2次，无水乙醇固定6 min，结晶紫染色6 min，水洗去除结晶紫，晾干后拍照并统计集落数。

2.2.7 细胞周期实验取对数生长期细胞，以 2.5×10⁵个·mL⁻¹细胞密度接种于6孔板每孔2 mL，培养24 h细胞贴壁后换DMEM培养基，饥饿处理24 h同步细胞周期，24 h后按“2.2.4”项下方法进行分组给药干预48 h，收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，轻柔吹散避免细胞成团。使用预冷的70%乙醇重悬细胞，4 ℃固定过夜，PBS洗涤1次，按试剂盒说明处理样本，流式细胞仪上机检测。使用ModfitLT 5软件分析各时期的细胞百分比。

2.2.8 Hoechst 33258染色取对数生长期细胞，以5×10⁵个·mL⁻¹细胞密度接种于12孔板，每孔1 mL，培养24 h细胞贴壁后，按“2.2.4”项下方法进行分组给药干预48 h。染色时吸除旧培养液，PBS洗涤3次，4%多聚甲醛溶液固定10 min，0.2% Tirtion透化5 min，每孔加入适量Hoechst 33258荧光染色液充分覆盖细胞，37 ℃避光染色8 min。弃染色液，PBS洗涤2次，荧光倒置显微镜下观察并拍照。

2.2.9 Rhodamine 123染色取对数生长期细胞，以2.5×10⁵个·mL⁻¹细胞密度接种于6孔板，每孔2 mL，培养24 h细胞贴壁后按“2.2.4”项下方法进行分组给药干预48 h。处理结束后收集细胞至EP管，PBS洗涤2次，加入Rhodamine 123，37 ℃避光染色30 min，流式细胞仪上机检测，使用FlowJo10.8.1软件分析探针荧光强度。

2.2.10 蛋白免疫印迹取对数生长期细胞，以 2.5×10⁵个·mL⁻¹细胞密度接种于6孔板，每孔2 mL，培养24 h细胞贴壁且融合率达60%时，按“2.2.4”项下方法进行分组给药干预48 h。收集细胞并使用RIPA裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度并制备样品。蛋白样品沸水浴中变性10 min，取30 μg总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，400 mA恒流湿转20 min至PVDF膜，室温封闭30 min，一抗4 ℃过夜，二抗室温孵育2 h，ECL化学发光法显影。使用Image J软件分析各蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参蛋白，计算目的蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3相对表达。

2.3 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行分析，以上数值均为进行3次生物学重复的，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 GEL作用靶点筛选结果

在SwissTargetPrediction和Pharmmapper数据库中进行GEL的作用靶点筛选，共获得303个预测靶点。基于OMIM、Genecards数据库检索，去重后共获得疾病靶点810个。通过Venny2.1.0在线绘图工具绘制Venn图，筛选后获得药物-疾病共同靶点49个（图1）。

3.2 GEL和TSCC交集靶点的PPI分析

将上述49个共同靶点输入STRING数据库，构建PPI网络，将靶点相互作用网络导入Cytoscape 3.10.1软件，绘制PPI网络图。在网络图中，节点代表蛋白，线条数表示蛋白间的关联度，节点越大颜色越偏向红色则度值越大，说明基因作用越显著。由图可示，表皮生长因子受体（EGFR）、雌激素受体1（ESR1）、含半胱氨酸的蛋白水解酶3基因（CASP3）、非受体酪氨酸激酶（SRC）、激酶插入区受体（KDR）等靶点的度值较高，在PPI网络中具有重要的联系作用（图2-A）。

3.3 核心靶点筛选

将PPI网络导入Cytoscape 3.10.1中，使用Cytohubba插件，通过MCC算法筛选出前10名作为核心靶点，其中前5位靶点为ESR1、CASP3、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、B淋巴细胞瘤2基因样1（BCL2L1）、SRC（图-2B）。

3.4 GO及KEGG富集分析

对49个共同靶点进行GO功能及KEGG通路富集分析。按照P值分别筛选GO功能中BP、CC和MF的前10条通路进行展示（图3），主要涉及酪氨酸蛋白激酶活性、蛋白激酶活性、以醇基为受体的磷酸转移酶活性、激酶活性等生物过程。KEGG信号通路分析中，按照P值降序排列，选取前15条通路（图4），主要涉及癌症途径（Pathways in cancer）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、癌症中的蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）、Ras信号通路（Ras signaling pathway）、MAPK信号通路（MAPK signaling pathway）等，这表明GEL抗TSCC的机制可能与上述信号通路有关。

3.5 分子对接

利用AutoDock Vina软件对筛选出的前5名核心靶点（ESR1、CASP3、MMP-9、BCL2L1、SRC）与GEL进行分子对接。结果显示GEL与5个核心靶蛋白的结合能分别为−28.56、−33.18、−27.30、−36.96、−27.3 kJ·mol⁻¹。结合能越低，提示受体和配体之间的亲和力越高。普遍认为，结合能＜−17.85 kJ·mol⁻¹表明配体与受体之间有一定的结合性；＜−21.0 kJ·mol⁻¹表示结合性良好；＜−29.4 kJ·mol⁻¹ 有强结合性^[10]。分子对接结果表明GEL和核心蛋白形成的构象能量低，尤其是与CASP3和BCL2L1有强结合性，与其余3个核心靶点结合性良好，筛选结果可靠，其分子对接模式见图5。

3.6 GEL对人舌鳞癌CAL27细胞形态的影响

随着培养时间延长，对照组肿瘤细胞生长状态良好；实验组肿瘤细胞生长变缓或停止生长，细胞体积缩小，形态固缩，细胞贴壁不牢或脱落，根据各个浓度干预细胞48 h的细胞融合度拟合出CAL27的 IC₅₀为285 μg·mL⁻¹。低浓度GEL抑制CAL27细胞生长，高浓度GEL抑制细胞生长并促进其凋亡，作用效果呈剂量相关性与时间相关性。选用150、250、350 μg·mL⁻¹作为GEL低、中、高质量浓度组，48 h为作用时间，进行下述GEL抑制CAL27细胞作用及机制研究（图6-A）。

3.7 GEL抑制人舌鳞癌CAL27细胞的增殖能力

GEL干预CAL27细胞24和48 h后，细胞增殖均被抑制，作用48 h抑制效果更为明显；以150、250、350 μg·mL⁻¹作用CAL27细胞48 h，抑制率约为25%、50%和70%（图6-B）。

3.8 GEL抑制人舌鳞癌CAL27细胞的克隆形成能力

与对照组比较，GEL干预CAL27细胞后细胞集落形成抑制明显，且有浓度相关性，以 350 μg·mL⁻¹ GEL对集落形成数量的抑制作用最强。GEL作用下，CAL27细胞的平均集落数由82个（0 μg·mL⁻¹）减少至7个（350 μg·mL⁻¹），见图7。

3.9 GEL阻滞人舌鳞癌CAL27细胞的细胞周期

与对照组比较，（250、350 μg·mL⁻¹）GEL干预CAL27细胞48 h后，G₂/M期比例显著增加（P＜0.001），S期比例下降，G₀/G₁期变化不明显，细胞周期受阻，GEL将CAL27细胞主要阻滞在G₂/M期（图8）。

3.10 GEL促进人舌鳞癌CAL27细胞凋亡

经Hoechst 33258染色后，对照组细胞形态完整，呈现边界清晰的椭圆形，细胞核形态规则，染色均匀；GEL组细胞数目减少，细胞皱缩且边界不清，细胞核固缩或碎裂，着色深浅不匀，具有凝聚的高亮蓝色颗粒，且凋亡细胞随GEL浓度升高而增多，表明GEL能够诱导CAL27细胞发生凋亡（图9）。

3.11 GEL诱导CAL27细胞线粒体膜电位丢失

与对照组相比，GEL处理组线粒体内Rhodamine 123荧光探针强度降低（P＜0.05、0.01、0.001），且呈现浓度相关性。表明GEL通过诱导CAL27细胞线粒体膜电位降低，导致线粒体功能紊乱，提示细胞发生坏死或凋亡（图10）。

3.12 GEL对人舌鳞癌CAL27细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表达的影响

与对照组相比，GEL高浓度组舌鳞癌CAL27细胞中Bax、Caspase-3蛋白表达水平显著升高（P＜0.01、0.001），Bcl-2 蛋白表达水平显著降低，Bax/Bcl-2值比例增高。表明GEL诱导CAL27细胞凋亡与激活Bax/Bcl-2 /Caspase-3信号通路有关（图11）。

4 讨论

TSCC是最广泛、最具侵袭性的口腔鳞状细胞癌（OSCC）^[11]，因其具有高度的局部侵袭性和早期向区域淋巴结转移的特点，死亡率较高，近年来TSCC的发病年龄呈现年轻化趋势^[12]。手术治疗辅以放化疗是目前TSCC的主要治疗方式^[13]，但手术治疗会导致颌面畸形、言语障碍、进食困难等问题^[14]，临床上常用化疗药物为铂类、嘧啶类，不良反应较大且易出现耐药问题^[15]，无法有效改善患者的预后和生存质量。因此，探索治疗TSCC的新药物迫在眉睫。

钩吻在民间主要用于肝、胃、乳腺、甲状腺等癌症的晚期治疗^[16]。由于钩吻总碱的中毒剂量与有效治疗剂量相接近，其应用非常受限。吲哚生物碱为钩吻抗肿瘤的有效成分，包括钩吻素、GEL、钩吻素乙、钩吻素己等^[17]，GEL在钩吻总碱中占比较大^[6]，且毒性相比其他单体成分较弱^[7]。研究发现，GEL对人肝癌细胞HepG2、人胃癌细胞MGC80-3、人食管癌细胞TE-11和人结肠癌细胞SW480均有抑制作用^[8]。但是目前尚无GEL抗TSCC的研究，其抗肿瘤效果及具体机制尚未明确。

本研究聚焦GEL抗TSCC的作用机制，通过绘制Venn图获得药物-疾病共同靶点共49个，经过PPI网络发现GEL作用于CAL27细胞的主要靶点包括ESR1、CASP3、MMP-9、BCL2L1、SRC等。ESR1在乳腺组织中广泛表达，并在乳腺癌等多种癌症中发挥关键作用^[18]，目前研究主要集中于耐药性乳腺癌的治疗^[19]，本研究通过网络药理学预测ESR1可能是抗TSCC的关键靶点之一，为耐药性口腔癌的治疗提供线索。CASP3是细胞凋亡途径的关键调节蛋白，有研究显示油酸通过Bcl-2/Caspase-3通路介导CAL27细胞凋亡，从而达到治疗TSCC的作用^[20]。MMP-9在肿瘤侵袭、转移和进展中起着至关重要的作用^[21]。已有研究显示，敲低MMP-9不仅通过抑制血管内皮细胞黏附及血管生成来抑制OSCC细胞增殖，还通过抑制肿瘤转移相关RhoC和Src基因来抑制口腔癌细胞的侵袭和转移^[22]。BCL2L1也称为BCL-xL，是Bcl-2家族蛋白中抗凋亡的成员之一，且BCL-xL被确定为Bax激活反应的主要调节因子，尤其是在实体瘤细胞系中^[23]。研究表明BCL2L1可以通过抑制P53的表达来抑制肝癌细胞中Caspase-3/7的表达，同时沉默BCL2L1可显著抑制肝细胞癌细胞的增殖、侵袭和迁移，促进细胞凋亡^[24]。SRC是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在促进肿瘤生长、侵袭、血管生成和耐药性的形成中起着至关重要的作用^[25]。有研究表明，SRC在OSCC中过度表达和高度激活，是一种驱动OSCC进展的癌症蛋白^[26]。

进一步对GEL和TSCC共同靶点进行信号通路富集分析，结果显示GEL通过影响多条信号通路干预TSCC，其中PI3K/Akt通路可能是GEL治疗TSCC的关键通路。PI3K/Akt通路参与包括增殖、凋亡和代谢等多种细胞过程^[27]，在PI3K/Akt通路中，TP53可以激活促凋亡蛋白Bax并且促进其表达上调，进而引起下游CASP级联反应，导致细胞凋亡^[28]。并且Akt激活的磷酸化可以抑制Bad表达,导致Bcl-2和Bcl-xL减少，这两种调节途径均可以导致细胞凋亡^[29]。相关临床研究表明，较高水平的Bcl-2与TSCC在内的多种肿瘤的不良预后有关^[30]。肿瘤细胞中Bcl-2/Bax值降低会触发Caspase-9/3的激活，并随后促进线粒体介导的细胞凋亡^[31-32]。

基于以上预测分析，以CAL27细胞为研究对象，从抑制细胞增殖并促进细胞凋亡的角度验证GEL抗TSCC作用。细胞增殖方面，通过Incucyte S3观察GEL干预影响CAL27细胞的形态，CCK-8实验与平板克隆实验验证GEL以时间相关性与浓度相关性抑制CAL27细胞增殖，并通过细胞周期实验证实GEL将CAL27细胞周期阻滞在G₂/M期。细胞凋亡方面，通过Hoechst 33258染色观察发现GEL干预下CAL27细胞发生核固缩、碎裂，采用流式细胞仪检测可见实验组线粒体内Rhodamine 123荧光探针强度降低，提示GEL诱导CAL27细胞线粒体功能紊乱，细胞发生坏死或凋亡。进一步验证GEL作用于CAL27细胞的主要凋亡相关靶点CASP3与BCL2L1，Western blotting显示随着GEL浓度的增加，CAL27细胞中Bax、Caspase-3表达增加，Bcl-2表达下降，表明GEL诱导CAL27细胞凋亡与激活Bax/Bcl-2/Caspase-3信号通路有关。

本研究通过网络药理学和分子对接技术，预测ESR1、CASP3、MMP-9、BCL2L1、SRC是GEL抗TSCC的关键靶点，且GEL与CASP3有强结合性，靶点功能主要集中于对肿瘤细胞增殖、侵袭、耐药及凋亡的影响。随后，实验验证GEL抑制人舌鳞癌细胞CAL27细胞增殖并促进其凋亡，进一步探讨关键靶点CASP3及其上下游靶点，证实GEL通过激活Bax/Bcl-2/Caspase-3信号通路促进CAL27细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤活性。该研究将有助于明确GEL发挥抗肿瘤作用的具体机制，并为GEL抗TSCC提供理论依据与潜在治疗靶点。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来源：赵昱倩，周欢思，金明静，李艳萍，王彬睿，卢春花．基于网络药理学与分子对接探讨钩吻素甲对舌鳞状细胞癌增殖与凋亡的影响 [J]. 药物评价研究, 2025, 48(1): 110-120.

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