干细胞衍生的神经类器官：从起源到下一代

摘要:干细胞研究的进步使研究人员能够生成类器官：具有生物结构和功能的三维组织。通过将类器官技术应用于人类多能干细胞，类器官提供了一个划时代的平台，用于在培养皿中研究人类发育，揭示健康和疾病中的细胞和分子行为。关于复杂的中枢神经系统，已经诱导生成了具有生理活动和神经连接的大脑皮层、海马体、小脑、下丘脑、垂体、神经视网膜和脊髓等多个脑区的类器官。这些成就将为我们带来许多优势，例如促进药物发现和推进未来的医学发展；另一方面，生成与体内对应物类似的人类脑组织引发了伦理问题，如类脑器官中意识的出现。本章首先关注神经类器官技术的历史和当前进展，然后从与可能的意识相关的多个视角，聚焦神经类器官研究的未来。

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1.引言

通过干细胞和类器官技术，实验室中生成类似器官的结构已经成为可能。这些相关领域近年来取得了显著进展。“类器官”是三维（3D）组织，它们重现了细胞和组织解剖学，包括由物种特异性遗传程序支持的体内发育过程。这些过程从多能干细胞（PSCs）开始，包括诱导多能干细胞（iPSCs）和胚胎干细胞（ESCs），或组织干细胞，从而允许我们研究调节器官形成的机制。2008年，研究人员首次创建了人类3D神经组织，这目前被认为是“神经类器官”的开创性工作。人工创建的人类脑组织为科学家提供了巨大的机会，以研究人类发育、先天性疾病、神经精神疾病和进化。值得注意的是，单细胞转录组方法揭示了与人类相关的遗传网络和信号通路。另一方面，这些工具和解释带来了伦理问题，即创建的脑组织可能具有与活人相关的意识。在本章中，我们首先提供这一重大科学成就的历史概述，主要关注2008年开创性工作之前和之后的情况。科学部分的后半部分介绍了如何从PSCs诱导3D神经组织，最终导致人类3D脑组织的诱导。随后，我们关注类器官技术在实验和临床应用中的进展。在审视了神经类器官技术的科学背景之后，我们引入了脑类器官技术的哲学和伦理方面，包括类器官意识的检测和可能成为问题的意识类型。通过从多角度审视神经类器官技术，本章提供了神经类器官在未来的潜在能力和局限性。

2.神经类器官研究：从干细胞到脑类器官的生成

神经类器官技术是应用发育生物学的重要成就。发育生物学的悠久历史揭示了与动态发育变化相关的多个因素，这为我们提供了如何在我们的身体在发育阶段形成深入的理解。影响这一领域的一个重大科学成就是ESCs的建立，因为这些在培养皿中培养的细胞可以在植入小鼠或注入胚泡时分别生成畸胎瘤或整个小鼠身体。PSCs的创建意味着它们可以在适当的培养条件下被诱导为3D组织，基于已知的发育因素。因此，ESCs的出现带来了创造性发育生物学的出现：从PSCs诱导组织/细胞。许多研究人员已经解决了这一主题。在诱导工作的早期阶段，已经实现了从PSCs的2D神经细胞诱导，例如中脑多巴胺能神经元诱导，现在被应用于帕金森病的细胞治疗。在2D安装之后，3D脑组织的非常开始是在2005年由Yoshiki Sasai小组进行的。

关于2D神经诱导方法，Sasai小组建立了使用饲养细胞和血清进行分化的多巴胺能神经元诱导。但是当他们尝试在无饲养细胞和血清的悬浮条件下进行诱导时，他们发现培养的分散的小鼠ESCs形成了几个具有大脑皮层特征的自我组织聚集体。那个意想不到的发现使小组发现了内在的分子机制，这些机制抵消了BMP信号活性以决定神经命运。有趣的是，通过添加神经诱导因子，如 sonic hedgehog、Wnt 和 BMPs，聚集体的特征可以被改变，就像体内情况一样，表明他们成功地诱导了重现大脑发育的微小3D小鼠脑组织。这项工作（SFEB：无血清悬浮培养胚胎体样聚集体）首次开发了具有亚区域规格的微小脑组织的3D诱导。然而，存在以下两个限制：

1.这种方法无法控制聚集体的大小，导致所需大小的诱导再现性低。后来，大小控制成为各种类器官和体外分化系统的已知关键因素，因为信号传播可能依赖于大小 - 依赖的信号模式。

2.应用于人类ESCs（hESCs）是复杂的，因为hESCs在解离后会发生细胞死亡。人类干细胞中的机制带来了新的分子参与者和途径，这些对于基于上皮细胞的类器官模型也很重要。

4.自发类器官轴的出现

Sasai团队在大脑类器官研究中的另一项进展是生成了各种区域特异性的神经类器官，包括大脑皮层、下丘脑、腹侧前脑、视杯、前脑垂体、小脑、海马、脉络丛、丘脑和脊髓。由于早期的神经视网膜是一种已知会显示出戏剧性形态变化的组织，眼类器官系统在体外优雅地解析了所有主要的哺乳动物特异性发育过程。这些新的实验工具使我们能够接触到在其他情况下难以达到的细胞和组织行为水平。例如，快速筛选已知调节发育过程的选择性抑制剂使我们找到了负责形态发生特异性的因子，如肌动蛋白。

时间依赖性的活性消耗识别了依赖于肌球蛋白激活的视杯形态发生，从而区分了机械信号和生化信号。基于细胞和组织形态发生，眼类器官系统还帮助构建了计算模拟，以预测可能的细胞和分子机制，这些机制在计算机上重现视杯形态发生。这些观察结果增进了我们对上皮形态发生的一般知识，以识别在其他上皮组织中常见的普遍机制。

视网膜中感光细胞的退化是导致视力丧失的原因。为了研究病理学并寻找可能的治疗方法，视网膜类器官已被用于修复啮齿动物和非人灵长类模型中退化的视网膜。视网膜在早期不需要血管支持其生长，这允许研究人员比其他中枢神经系统类器官更成熟地发育视网膜。

诱导组织区域化高度依赖于发育信息（图3a）。Sasai团队首先确定在制造3D神经组织的最小必需培养基下诱导的区域是下丘脑。基于这项工作，添加几种因素以在适当的时机控制前后/背腹轴可以改变体内发育中的诱导区域。通过这一概念实现了前脑和视杯的背腹轴、小脑浦肯野细胞和脊髓的作用（图3b）。

图3 神经管区域与相应的神经诱导条件。

例如，其中一个关键因素是Wnt信号，它调节自组织系统中的发育过程，如视杯的背腹轴和神经外胚层的前后轴。为了展示如何产生新的区域诱导条件的细节，这里我们展示了海马类器官工作的概要（图4）。由于海马区域出现在位于前脑背内侧部分的内侧壁（图4a），通过适当背化大脑类器官条件实现了海马诱导。大脑类器官诱导条件主要由三部分组成；早期阶段通过添加TGF-beta抑制剂诱导前脑神经上皮，并通过Wnt抑制剂使组织前移；中期诱导类似大脑皮层的结构；以及需要Matrigel、高氧条件和培养基中许多营养物质的成熟后期。Sakaguchi等人首先发现，从培养第18天起持续添加重要的背化因子到大脑类器官中，诱导了位于前脑最背侧的完整的3D脉络丛组织。通过减少背化因子添加的时间，他们接下来发现适度背化大脑组织诱导了前脑的背内侧部分，包括脉络丛、皮质半球和产生未来海马的内侧壁（图4b）。长期培养诱导的背内侧前脑组织在齿状回产生了功能性海马颗粒神经元和CA3区的锥体神经元。这一成就是现在被认为是脉络丛类器官和海马类器官的诱导。Sasai团队的另一系列工作也是通过将发育信息应用于干细胞技术来完成的，如这里所示。

5.神经类器官研究的未来发展方向

尽管神经类器官具有直接的实用性，但仍需解决许多挑战，包括大脑结构的不完全重现、大小、成熟度、血管化、层化以及缺乏输入/输出系统、外部刺激和非神经外胚层细胞。目前，研究人员正尝试通过几种方法解决这些挑战。第一种方法是培养方法的精细化。已经存在几种方法，例如使用导线培养以形成长的神经上皮结构，使用生物工程培养设备进行更好的分层培养（Qian等人，2016年）或使用类器官切片培养。一些研究人员通过将类器官移植到动物大脑中来实现类器官的成熟和血管化。通过将类器官放入宿主大脑环境中，移植的类器官可以与宿主大脑的血管化同步成熟。移植还可用于治疗某些疾病，通过补偿大脑中丢失或受损的区域。一篇论文显示，移植的大脑类器官在小鼠和猴子大脑中沿皮质脊髓束延伸轴突，其他论文声称大脑类器官的移植可以挽救由机械/缺血性脑损伤引起的运动功能障碍。为了获得输入/输出系统，一些研究人员尝试融合类器官或球状体以在几个区域之间建立神经连接，例如大脑-丘脑和大脑-脊髓-肌肉。最后，关于缺乏非神经外胚层细胞的问题，一些研究人员正尝试将小胶质细胞放入大脑类器官中，以制作更完整的类器官，重现大脑的免疫系统。这些方法一直在开发中，许多科学家旨在增强大脑类器官，以充分重现发育中的人类大脑，更好地模拟人类发育和人类神经疾病。

类器官也被用于人类发育和进化研究。几份报告比较了大脑类器官与人类胎儿组织，以解读发育成熟度和多样性的不足。最近，对尼安德特人大脑的建模研究表明，在现代人类与尼安德特人分化后，新皮质发育过程中染色体分离的准确性得到了提高。因此，神经类器官技术对人类神经研究的未来产生了非凡的影响，并有望为下一代在神经科学、神经发育、进化和基础/应用医学领域的大脑研究铺平道路。

6.人类神经类器官与意识

如上所述，神经科学中的类器官技术迅速扩展，大脑类器官的技术发展使得创建更成熟、解剖学上更完整的大脑类器官成为可能，这些类器官显示出功能上、生理学上相关的活动。随着这一点，一些人认为产生的大脑组织可能具有与意识、认知和思维相关的精神活动。有人提出了一个担忧，参考哲学家Hilary Putnam 40多年前提出的著名思想实验“缸中之脑”——人类大脑被放置在特定环境中，例如连接到复杂的计算机程序，将拥有与普通成年人相同的意识。在这一部分，我们尝试介绍和讨论关于大脑类器官意识可能性的伦理和哲学方面，以更好地理解这个话题，这可能会吸引更多的科学、伦理、哲学和公众关注。

7.使用人类大脑类器官的功能研究进展引发了伦理讨论

当我们在PubMed网站上搜索“大脑类器官”和“伦理”这两个词时，从2017年开始点击次数开始增加。如果我们将“大脑类器官”与“意识”放在一起，从2018年开始数量增加，并持续急剧上升。这表明2017-2018年左右是关于大脑类器官和意识伦理讨论的非常早期阶段，与使用大脑类器官的功能评估的发展相吻合。例如，在2017年，几项研究尝试对大脑类器官进行功能评估以显示任何脑活动。由于大脑类器官的功能研究需要技术来创建成熟的大脑类器官，然后是评估技术，因此当时很难展示复杂的神经活动：大部分工作揭示了功能的存在，包括大脑类器官中的同步活动作为许多其他数据之一。一项研究表明，他们诱导的大脑类器官包含视网膜细胞亚型，并且他们展示了这些细胞对光刺激作出反应，导致大脑类器官中的电活动。由于大脑活动与体内意识高度相关，这些研究为科学家提供了未来类器官研究的首次伦理思考机会，例如意识的可能性。实际上，在2019年，一项研究声称，产生的微型大脑产生了类似于早产儿的电模式，数据的呈现引发了许多关于结果的讨论。之后，关于大脑类器官研究在意识方面的伦理辩论变得热烈。在那段时间左右，一些复杂的大脑类器官功能研究发表了：其中一项研究显示了复杂的活动，包括来自大脑类器官的神经网络中的同步/不同步活动。另一项研究显示了来自雷特综合症患者的大脑类器官中的癫痫样活动。使用大脑类器官的功能分析取得了稳步进展，这带来了进行伦理讨论和大脑研究指南的需求。

8.与人类类脑器官意识检测相关的方法论限制

讨论与脑类器官可能意识相关的伦理问题时，最具挑战性的一点是检测脑类器官的意识。意识已在许多研究领域被研究，包括医学、神经科学、哲学、心理学等，意识的定义和评估各不相同。在医学领域，意识是通过患者对一些问题和/或刺激的反应/反应来评估的。相比之下，在神经科学领域，它通常是通过活细胞/组织成像或模型动物的电活动来评估的，然后比较行为活动的变化。这些测量的意识水平或通过神经活动干预改变的意识水平是评估意识的常见方式。哲学对广泛定义更为宽容，心理意识通常关注主观体验。当我们评估脑类器官的神经活动时，我们通常检测细胞/网络级活动。使用贴片钳方法、钙成像和多电极阵列（MEA）记录细胞外电位来评估脑类器官内的神经或神经元网络活动。在MEA中，测量附着在每个电极上的神经元的细胞外电位，并且从多个记录点进行电生理学评估，可以高时间分辨率评估神经网络的功能。钙成像是一种评估由CA2+离子与钙指示剂结合引起的时间序列荧光变化的方法，这些变化通过荧光显微镜系统可视化。使用多光子荧光显微镜，可以观察到从表面较深处位置的类器官成像。因此，可以从神经科学的角度观察脑类器官中的神经功能。尽管如此，解释困难的是没有来自脑类器官的响应。在人类测试中，受试者会做出反应；在动物测试中，观察者可以判断所有动物的行为和反应。相比之下，在类器官测试中，类器官从不表现出任何行为或做出反应，只存在神经活动。因此，将神经活动与意识的可能性联系起来变得更加困难。这种问题被称为“意识的硬问题”：解释为什么以及大脑中电/化学反应的物理组合如何创造出主观体验，如现象意识和感受质。为了克服这个复杂的问题，神经科学方法也将应用于脑类器官研究。Lavazza和Massimini在2013年提出了一个用于意识水平检测的指数，称为扰动复杂性指数（PCI），它与意识理论——整合信息理论（IIT）有理论联系。IIT假设意识的产生需要多样化的信息。信息被整合，意识基于可以内部产生整合信息的因果信息结构。IIT甚至接受由整合信息组成的简单系统，如果系统具有因果信息结构，则可以拥有意识。当我们接受IIT时，意识水平可以表示为整合信息的数量，高数量与提高的意识水平相关。PCI的原始数据是通过经颅磁刺激（TMS）的脑电图（EEG）获得的。TMS刺激后EEG检测到的瞬时电变化反映了基本的电活动。基于IIT，例如，当受试者清醒时电负荷很重要，反之亦然。在PCI中，1分与高意识水平相关，0分与低意识水平相关。Lavazza和Massimini证明，低分反映了麻醉情况、非快速眼动睡眠和植物状态。值得注意的是，一些意识水平看似低但实际存在大脑活动的患者（例如，后来恢复的闭锁综合征或昏迷状态患者），得分显示为中等（不是0），表明PCI可以评分意识水平，并可能客观评估意识水平。如果意识的硬问题通过IIT和PCI完全解决，PCI的应用将有助于检测脑类器官的意识水平。然而，目前，PCI需要来自临床信息的反馈，如患者的清醒水平，可以说将IIT/PCI应用于类器官研究可能还不现实。此外，PCI评估在类器官研究中的应用似乎不可行，因为TMS调制与EEG记录的方法需要一个大脑，尽管当前类器官缺乏这一特征。此外，当前脑类器官也缺乏适当的感觉输入/运动输出系统来获取整合信息。这些方法论和概念限制表明，脑类器官中意识可能的出现的问题目前并不紧迫。但假设，一旦在PCI微设备的多空间下实现复杂的神经回路，允许感觉输入/运动输出，可以对类器官进行PCI评估。在现有生物标志物的新应用得以证明之前，我们需要更多关于不同类器官架构的知识以及哪些类型的信号被视为正常大脑中意识的证据。

9.与人类脑类器官研究相关的未来伦理辩论

随着2017-2018年左右对脑类器官研究伦理方面的关注增加，发表了许多伦理观点和文章。通常，早期阶段的论文限于一些讨论提议和相关主题的概述。这种限制部分来自意识的复杂问题；在类器官中检测意识很困难，问题仍然是概念性的。类器官意识的可能性仍然是不可预测的，需要用当前技术来解决。因此，进行类器官研究可能很困难。需要进一步的神经科学发现来确定细胞活动模式是否被编码成有意义的信息，以论证培养皿中的意识。

随着该领域朝着某个方向发展，我们推测；然而，可能会产生额外的伦理问题。例如，与融合类器官相关的研究，试图将脑类器官与其他神经类器官/球状体连接起来，在技术上可能成为可能。融合人类脑和神经类器官的概念将带来新的伦理挑战。Xiang等人报告了建立相互的丘脑皮层投射。由于丘脑是感官输入到大脑皮层的门户，这样的发现可能将感官信息传递给脑类器官。如果融合的类器官进一步与背脊髓和/或周围神经融合，类器官可能会重现体感单元。在这种情况下，可能会出现一个问题，即是否允许创造和使用具有感知环境能力的脑类器官。随着更复杂的脑类器官的发展，我们也可能想知道是否允许使用人类脑类器官来感受疼痛，以发展用于管理或减轻疼痛的药物。

此外，使用人类脑类器官进行体内实验需要不同的伦理标准和监督机制，因为它们可能会带来动物大脑人源化的嵌合体动物。有人建议，人类脑类器官的移植应该逐步进行，并且应该密切监测宿主动物的身体和行为变化。目前，所有将任何类型的人类细胞植入研究动物的研究都是按照模型动物研究的科学和伦理标准进行的。国际干细胞研究协会（ISSCR）已经推荐了如何进行这类研究；然而，有些人可能需要研究领域在进行这类研究之前更具体地讨论。即使体外脑类器官的意识问题不可行，脑类器官的使用范围广泛，融合类器官或移植类器官可能会带来额外的伦理辩论。科学家将需要在与伦理、哲学、心理学和法律领域的研究人员以及公众和相关方的对话中进行仔细评估。

10.结论

正如我们在第一节中所展示的，神经类器官技术是大脑发育信息应用的结晶。在培养皿中3D发育的人类神经组织的“剪切和粘贴”技术为接触人类大脑生物学和病理学铺平了道路。尽管有许多好处，我们也展示了一个名为“缸中之脑”的思想实验的可能实现，以及与检测脑类器官中的意识相关的伦理辩论。为了推动下一代脑科学中的神经类器官技术，科学家必须关注技术和发展、伦理问题以及公众共识。

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