Weissman最新|Ab-LNP递送mRNA用于构建α-地贫小鼠疾病模型

导读：α-地中海贫血(α-Thalassemia, AT)是最常见的遗传性血液病之一，同种异体骨髓移植(Bone Marrow Transplantation, BMT)是严重患者唯一可选择的治疗方法。目前，成年小鼠模型建模困难，对α-地中海贫血的研究极为有限。

2024年10月，诺奖得主Drew Weissman团队在Blood（Q1，IF=21）上发表了一篇题目为《Use of HSC Targeted LNP to Generate a Mouse Model of Lethal α-Thalassemia and Treatment via Lentiviral Gene Therapy》的文章，提出通过靶向受体CD117-LNP递送Cre mRNA，成功完成了严重α-地中海贫血小鼠模型的构建。今天，菌菌将和大家一起学习mRNA、Ab-LNP技术在小鼠疾病模型构建中的最新应用。

应用技术：IVT mRNA、抗体偶联LNP（Ab-LNP）、基因编辑、基因敲除、Cre-loxP系统、β-地贫骨髓细胞输注、小鼠疾病模型构建、数字PCR（ddPCR）、高效液相色谱法（HPLC）、免疫组化（IHC）等

α-地中海贫血是由α-珠蛋白肽链的合成受到部分或完全抑制，导致血红蛋白合成不足而引发的遗传性溶血性贫血，呈常染色体隐性遗传。α-珠蛋白基因簇位于16号染色体上（16p13.3），成人中HBA2基因的表达量高于HBA1基因。疾病严重程度通常与受影响的α-珠蛋白链减少的程度直接相关。患者按症状轻重可分为血红蛋白H病和Bart’s水肿胎综合征。前者多表现为中度溶血，通常因为小于30%的α-珠蛋白链表达，β链表达过剩而形成高水平β珠蛋白四聚体(High Levels of β-globin Tetramers, HbH)，因为其不稳定，易分解为游离的β链并沉积聚集形成包涵体，使红细胞受损，导致慢性溶血性贫血。大部分患者发育正常，日常生活无明显影响，不需要输血，老年患者可能由于慢性溶血导致铁过载。后者为致死性疾病，因为α珠蛋白完全无表达，胎儿体内仅有γ四聚体，在低氧状态下无法释放O2，同时易解离成游离的γ链，其氧化物可直接损伤红细胞膜，使红细胞寿命缩短，加速溶血。受累胎儿由于严重贫血和缺氧，常在妊娠23～38周在宫内或分娩后半小时内死亡。迄今为止，已发现和记录的AT基因缺失或非缺失等位基因超过400种，目前治疗选择最少的AT对医疗系统来说是一个日益增加的公共卫生负担。

图1 AG-KO小鼠模型的建立及相应表征

发现移植后6-8周，AG-KO小鼠表现出高嵌合性（>90%供体造血细胞），具有严重的表型，包括低水平的α-珠蛋白链，高水平的β-珠蛋白四聚体(High Levels of β-globin Tetramers, HbH)。通过高效液相色谱（图1D）测量，红细胞膜上(Red Blood Cells, RBC)存在β-珠蛋白沉淀。且相较于缺乏β-珠蛋白基因的野生型小鼠(Wild Type, WT)，红细胞压积(Hematocrit, HCT) （68.2±1.2%比WT组的43.2±1.0%）和RBC（13.0±0.4比WT组的9.1±0.2 106/μL）显著升高（表1）。

进一步分析AG-KO小鼠的骨髓和脾脏，发现总细胞量明显增加（骨髓和脾脏分别比WT组增加1.5倍和10倍），祖红细胞数量明显增加（骨髓和脾脏分别增加2.0倍和10倍），尤其是成红细胞和网织红细胞数量增加（图1E、1F），还表现出其他异常的红细胞参数，包括红细胞寿命缩短，肾脏中促红细胞生成素(Erythropoietin, EPO)mRNA水平高（图2A），平均血红蛋白(Mean Corpuscular Hemoglobin, MCH) （11.4±0.3比WT组的14.4±0.2 pg）和平均血红蛋白浓度(Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration, MCHC)水平（21.6±0.2比WT组的30.2±0.4 g/dL）降低，网状红细胞计数(Reticulocyte ,RET)增加460%（表1）。

图2 不同品系小鼠的基因表达情况

通过将AG-KO-CD45.2-GFP-（mRNA^CreLNP^CD117处理的lin- Hba-a1-cKO HSC）和WT-CD45.2^-GFP⁺HSC（WT lin^- HSC）混合移植于骨髓丧失的CD45.1 GFP^-小鼠体内，创建不同比例AG-KO和WT HSC移植的动物。通过定量CD45.1和CD45.2细胞的水平来评估骨髓中的供体嵌合和RBC的比例。移植后6-8周，接受100%和80% AG-KO HSC的动物显示出相似的RBC和RET增多。移植80% AG-KO HSC的小鼠在循环中显示出GFP^- RBC细胞的优势比例，相比之下，移植60%、40%和20% AG-KO HSC的动物，循环中GFP⁺ RBC的比例很大。因此，100%和80% AG-KO动物的血清VEGF（缺氧指标）和血清EPO水平升高。这也表明，即使低比例的正常红细胞在循环中也可以减轻严重缺氧和EPO合成。

2.3 AG-KO小鼠氧结合能力提高

使用不同比例表达GFP^-和GFP⁺ RBC的小鼠，将氧平衡曲线与α：β珠蛋白水平和Hill系数（一个量化氧分子与Hb正或负协同作用的参数）相关联，发现WT移植小鼠的p50值为32.6，AG-KO移植小鼠的p50值为10.7，表明AG-KO小鼠的RBC具有很强的高氧结合亲和力（图1G）。这些红细胞显示出较低的Hill系数（在100% AG-KO HSC移植的小鼠中为0.86，而在WT中为2.30），表明协作性显著降低。

在β-地中海贫血中，因为高水平的活跃红细胞生成，抑制铁调素表达（HAMP基因编码蛋白，控制和限制从十二指肠吸收膳食铁），导致患者和小鼠不输血也会出现铁超载。AG-KO小鼠表现出较高的红细胞生成能力，但肝脏中铁调素的表达水平非常低（<5%的对照组WT小鼠，图2B）。而且小鼠器官显示出明显的形态异常，脾脏肿大（图2C），红白髓分裂完全破坏（图3A），巨噬细胞内无铁残留，肝脏表现出明显的铁超载迹象（图3B）。

图3 不同品系不同组织的病理

2.5 AG-KO小鼠微血管闭塞

由于异常红细胞的增加，AG-KO小鼠表现出微血管闭塞的特征，包括呼吸频率增加和旋转或肢体丧失的卒中相关症状。通过脑（图3C）和肺（图3D）的分析，观察到弥漫性微血管闭塞和大量红细胞，纤维蛋白原染色呈弥漫性阳性且与血管相关内皮细胞共定位（图3C、3D），提示凝血活化。

2.6 与AG-FLC相比，mRNA-LNP建模更具优势

从缺失Hba-a1和Hba-a2的小鼠E14.5胚胎中收集FLC并进行基因分型，以确定纯合子小鼠，杂合子小鼠具有与代偿性网状细胞缺乏症相关的轻度表型，而纯合子小鼠具有胚胎致死性。将纯合子KO胚胎的E14.5-FLC移植到骨髓缺失的受体动物（标记为AG-FKO小鼠）中。AG-FKO嵌合体重现了在AG-KO小鼠中观察到的表型，包括β-珠蛋白沉淀，α-珠蛋白链合成减少，HPLC测定HbH的产生，脾肿大，红细胞参数异常，脾脏和肝脏形态异常，铁超载。从中观察到，与WT-FLC相比，需要10倍的AG-FLC来持续植入受体小鼠，从治疗的角度来看，这一限制使得将该模型用于下游应用过于具有挑战性。而且mRNA^CreLNP^CD117建模提供了高水平Hba-a1和Hba-a2基因缺失的HSC的一致来源。

在α-地中海贫血小鼠中，无效的红细胞生成和过多的异常红细胞导致观察到的许多器官病变，包括脾肿大和肝脏铁超载。同时，红细胞增多有利于形成凝块和富纤维蛋白而导致血管闭塞性血栓的发生。在过去几年中，新疗法的研究和开发取得了显著的成功，最值得注意的是FDA批准了Zynteglo和Lyfgenia，这是一种基于慢病毒的体外治疗β-地中海贫血和镰状细胞病的药物。相比之下，尽管AT是一项重大且日益增长的医疗挑战，但它只得到了一小部分关注。本篇文章作者通过构建AG-KO和AG-FKO小鼠模型，但AG-KO建模提供了高水平Hba-a1和Hba-a2基因缺失，这里描述的严重AT小鼠模型可以成为未来研究的有力工具，并为人类患者提供研究途径。

图4 AT的一种新型重症模型及其基因互补治疗

目前，mRNA的多项应用潜能已实现概念验证，涵盖mRNA疫苗、mRNA免疫疗法、mRNA介导的蛋白替代疗法、基因编辑疗法或细胞疗法。除自身的药用价值外，mRNA也是一种优秀的生物制药开发工具，如使用mRNA作为免疫原筛选单克隆抗体、基于mRNA-LNP构建小鼠疾病模型等。

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