细胞病变抑制法检测巨细胞病毒中和抗体效价的适用性验证

目的   验证细胞病变抑制法检测血浆和静注巨细胞病毒人免疫球蛋白（pH4）（human cytomegalovirus immunoglobulin for intravenous injection，CMV-IVIG）的巨细胞病毒中和抗体（human cytomegalovirus neutralizing antibody，CMV-NA）效价的适用性。

方法   采用巨细胞病毒人免疫球蛋白国家标准品建立CMV-NA效价检测细胞病变抑制法。采用CMV-NA血浆和CMV-IVIG验证细胞病变抑制法的重复性、中间精密度、专属性、准确性、耐用性、重现性。

结果   血浆和CMV-IVIG的CMV-NA效价重复性验证的相对标准偏差分别为12%和19%。2名实验人员重复检测6次血浆和CMV-IVIG的CMV-NA效价，其F值分别为0.84和0.03，P值均＞0.05。不同日期下重复检测6次血浆和CMV-IVIG的CMV-NA效价，其F值分别为0.89和0.55，P值均＞0.05。血浆、CMV-IVIG和国家标准品溶液的细胞均无病变。血浆和CMV-IVIG加标样品的回收率均在100%±40%之间。采用不同中和时间检测血浆和CMV-IVIG的CMV-NA效价，F值分别为0.48和0.04，P值均＞0.05。采用不同病毒滴度范围检测血浆和CMV-IVIG的CMV-NA效价，F值分别为0.49和0.11，P值均＞0.05。2个实验室检测CMV-IVIG的CMV-NA效价，t值为0.69，P值＞0.05。

结论   细胞病变抑制法检测CMV-NA效价具有良好的重复性、中间精密度、专属性、准确性、耐用性和重现性。

巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）为疱疹病毒科β属的双链DNA病毒，在我国人群感染率高达86%~96%。虽然绝大多数成年感染者无临床症状，但当机体免疫功能低下时，病毒可被激活发生显性感染。孕妇初次或复发CMV感染引起的宫内感染或围产期感染侵袭胎儿，是导致人类先天畸形的重要原因之一。目前已有多种CMV疫苗进入临床试验，至今尚无 CMV疫苗上市，疫苗的有效性和安全性还有待进一步研究。国外普遍使用抗病毒药物联合CMV特异性人免疫球蛋白治疗CMV感染及相关疾病，国内尚无相关免疫球蛋白产品上市。

成都蓉生药业有限责任公司（成都蓉生）研制的静注巨细胞病毒人免疫球蛋白（pH4）（human cytomegalovirus immunoglobulin for intravenous，CMV-IVIG）系从健康人血浆中筛选的含高效价巨细胞病毒中和抗体（human cytomegalovirus neutralizing antibody，CMV-NA）的血浆制备而来。CMV-IVIG的有效性指标取决于CMV-NA效价，建立稳定高效的CMV-NA效价检测方法尤为重要。本研究验证细胞病变抑制法检测血浆及CMV-IVIG的CMV-NA效价适用性，为CMV-IVIG在临床上的有效性提供更好的保证。

高效价CMV-NA血浆1批（批号：P-001）、CMV-IVIG 8批（批号：CMV-IVIG-001—CMV-IVIG-008），均由成都蓉生研制。

CMV人免疫球蛋白国家标准品（批号：280025-201501）由中国食品药品检定研究院提供，人胚肺成纤维细胞（MRC-5）和CMV均购自美国典型培养物保藏中心。

MEM基础培养基购自美国 Gibco公司，胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司。BSC-1500IIA2-X生物安全柜购自济南鑫贝西生物技术有限公司，XDS-1B倒置显微镜购自重庆光电仪器有限公司。

用细胞维持液（2%胎牛血清）2倍系列稀释CMV国家标准品和检测样品，将其分别加至细胞培养板，50 μl/孔，10个复孔检测。将100 CCID₅₀的CMV病毒液加至样品检测孔和病毒对照孔（50 μl/孔），于37 ℃、5% CO₂中和2 h。将MRC-5细胞消化重悬至细胞密度为（0.8~1.2）×10⁵ ml^-1，加至样品检测孔和病毒对照孔（100 μl/孔），于37 ℃、5% CO₂培养至第10天，用倒置显微镜观察孔内MRC-5细胞病变情况，孔内出现梭形细胞则认定为细胞发生病变。采用Karber法计算样品及国家标准品测定效价，从而得出样品效价。

以CMV-IVIG-001为代表样品进行CMV-IVIG的CMV-NA效价检测方法验证。

1.3.1　重复性　取稀释倍数为16的血浆和稀释倍数为64的CMV-IVIG样品，由同一实验人员重复6次测定其CMV-NA效价，6次检测结果计算的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）应≤40%。

1.3.2　中间精密度　取稀释倍数为16的血浆和稀释倍数为64的CMV-IVIG样品，由2名实验人员分别测定其CMV-NA效价各6次；由同一实验人员在不同日期对样品的CMV-NA效价各检测6次，计算RSD，RSD应≤40%。

1.3.3　专属性　枸橼酸钠、麦芽糖分别为CMV-IVIG和血浆中添加的辅料，根据CMV-IVIG和血浆加样检测的最高浓度，将CMV-IVIG、国家标准品溶液、血浆、质量体积分数0.25%枸橼酸钠溶液、100 g/L麦芽糖溶液分别进行64、32、16、16、64倍稀释。检测枸橼酸钠溶液和麦芽糖溶液时加入CMV病毒液（100 CCID₅₀/0.05 ml），分别重复检测6次。可接受标准为CMV-IVIG、国家标准品溶液、血浆的细胞无病变，枸橼酸钠溶液和麦芽糖溶液的细胞全病变。

1.3.4　准确性　将效价与国家标准品溶液接近的血浆和CMV-IVIG溶液分别与国家标准品溶液等量混合作为血浆加标样品和CMV-IVIG加标样品。计算6次试验结果的加标回收率。检测标准为血浆加标样品和CMV-IVIG加标样品的回收率在100%±40%之间。

1.3.5　耐用性　分别采用中和时间105、120、135 min，重复检测3次稀释倍数为16的血浆和稀释倍数为64的CMV-IVIG样品的CMV-NA效价。

选择病毒稀释倍数为20、40、50，病毒滴度在32~320 CCID₅₀/0.05 ml范围内的CMV病毒液，重复检测3次稀释倍数为16的血浆和稀释倍数为64的CMV-IVIG样品的CMV-NA效价。

1.3.6　重现性　将稀释倍数为64的CMV-IVIG的8批样品分别在2个不同的实验室检测CMV-NA效价。

采用EXCEL 2021软件进行统计学分析，中间精密度的检测结果采用无重复双因素方差分析，耐用性的检测结果采用单因素方差分析，重现性采用t检验分析，P<0.05为差异有统计学意义。

血浆和CMV-IVIG的CMV-NA效价检测结果的RSD分别为12%和19%，表明本检测方法具有良好的重复性，检测结果见表1。

血浆CMV-NA效价的检测结果显示，不同实验人员6次检测CMV-NA效价的F值为0.84，P值为0.401；同一实验人员不同日期检测6次CMV-NA效价的F值为0.89，P值为0.551，12次检测结果的RSD值为19%。CMV-IVIG的CMV-NA效价检测结果分析显示，不同实验人员6次检测CMV-NA效价的F值为0.03，P值为0.872；同一实验人员不同日期检测6次CMV-NA效价的F值为0.55，P值为0.734，12次检测结果的RSD值为17%。该细胞病变抑制法检测血浆和CMV-IVIG的CMV-NA效价的中间精密度良好，结果见表2。

结果显示，CMV-IVIG、国家标准品溶液、血浆的细胞均无病变，表明其对细胞无毒性；枸橼酸钠溶液和麦芽糖溶液的细胞全病变，表明其对病毒引起的细胞病变无抑制作用。本检测方法专属性良好。

血浆加标样品检测6次的加标回收率在74%~137%之间，CMV-IVIG加标样品检测6次的加标回收率在91%~133%之间，本检测方法具有良好的准确性，结果见表3。

当中和反应时间为105、120、135 min时，血浆和CMV-IVIG 的CMV-NA效价检测结果的F值分别为0.48和0.04，P值分别为0.642和0.957，表明中和时间在（120±15） min对血浆和CMV-IVIG的CMV-NA效价无明显影响，结果见表4。

当病毒滴度在32~320 CCID₅₀/0.05 ml范围时，对血浆和CMV-IVIG的CMV-NA效价检测结果无明显影响，其F值分别为0.49和0.11，P值分别为0.634和0.902。以上数据表明本检测方法具有良好耐用性，结果见表5。

2个实验室检测8批CMV-IVIG的CMV-NA效价结果显示，其t值为0.69，P值为0.514，即本方法具有良好重现性，结果见表6。

检测巨细胞病毒中和抗体的免疫学方法有中和试验、补体结合试验、间接血凝试验、ELISA、放射免疫法等。目前常用的方法主要是中和试验和ELISA，其中，中和试验在筛查高效价CMV血浆方面特异性好，但是操作复杂、技术不够成熟；ELISA在筛查高效价CMV血浆方面操作简便、技术成熟，但是特异性较差，且试验结果与CMV-NA相关性很差，不能反应样品中和抗体效价的真实水平。郭冰峰等采用微量中和细胞检测法筛出的血浆制备的CMV-IVIG比普通静注人免疫球蛋白的CMV-NA高出4倍，符合特异性免疫球蛋白标准。成都蓉生早期建立的细胞核着色法具有检测快速、检测结果准确等优势，但该方法实验操作繁琐、对检定人员要求较高。

此次建立的细胞病变抑制法，虽然检测时间较长，但实验操作相对简单，效价结果准确客观，符合检测使用要求。本研究根据待检样品和中和抗体效价检测方法本身的特点，使用中国药典2020年版四部分析方法验证指导原则，对细胞病变抑制法检测巨细胞病毒中和抗体效价的适用性进行了验证。结果表明，本研究建立起的细胞病变抑制法具有良好的重复性、中间精密度、专属性、准确性、耐用性以及重现性。后续将进一步研究以国家标准品为检测标准的细胞病变抑制法替换细胞核着色法在等效性方面的可行性。

田倩¹  漆育林¹  刘珣¹  章俊¹  杜盛华¹  刘波¹  张聪明¹  孙勇²  林涛¹

¹成都蓉生药业有限责任公司质量检定部，成都  610219；²成都蓉生药业有限责任公司制剂室，成都  610219

通信作者：林涛，

Email：63461504@qq.com

引用本文：田倩, 漆育林, 刘珣, 等. 细胞病变抑制法检测巨细胞病毒中和抗体效价的适用性验证 [J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(5): 292-296.  

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20231220-00025