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Bio-101是Bio-protocol旗下的中文生命科学实验方案共享平台。通过与四百多个国内优秀课题组合作，以及上千名专家的共同努力，平台已出版九本高质量、同行评审、开放获取的中文实验方案电子手册，促进了中国科研人员之间的交流与合作。每周末，小bio将与大家分享其中的文章，本次是中国科学院分子细胞科学卓越创新中心动物实验技术平台吴宝金团队的题为“小鼠超数排卵和成熟卵母细胞的采集”的方法文章。
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先后给雌鼠注射促性腺激素PMSG及HCG，使小鼠的生殖周期及排卵时间同步化，增加排卵数量，用于需要大量小鼠卵母细胞或着床前胚胎的实验。关键词：超数排卵 孕马血清促性腺激素（PMSG） 人绒毛膜促性腺激素（HCG）
1. 培养皿 ：35 mm、60 mm、100 mm（Corning，货号：353001、353002、353003）2. 胚胎移植口吸管（北京吉田生物科技有限公司，规格：1.0*500 mm）3. 移液枪头（Axygen，货号：T-300-R-S、T-1000-B-R-S、T-200-Y-R-S）4. 无菌注射器（上海米沙瓦医科工业有限公司，规格：1 mL）5. 移液管（10 ml，corning 货号：CLS4488-200EA）6. 离心管（1.5ml，Axygen 货号：MCT-150-C）动物：提前一周从供应商订购供体雌鼠（动物周龄参考表1），并饲养在独立换气系统笼盒内，动物自由饮水、自由采食经Co60辐射的灭菌饲料。2. 孕马血清促性腺激素PMSG、人绒毛膜促性腺激素（HCG） (生产商：宁波三生生物科技有限公司）4. FHM胚胎操作液（EmbryoMax FHM HEPES Buffered Medium）（Milipore 货号：MR-025-D）5. 透明质酸酶（HY）（SIGMA 货号：H3506）6. KSOM胚胎操作液（KSOM Mouse Embryo Media）（Milipore 货号：MR-121-D）2. 移液枪（200 μl，eppenddorf）3. 超净工作台（万里，型号：SW-CJ-2FX）4. CO2培养箱（THERMO，型号：i160）5. 体视显微镜（Nikon，货号：SMZ800）1. PMSG和HCG试剂配制（方法见溶液配方）。2. 取一只无菌注射器，吸入PMSG稀释液，抓取供体小鼠单手保定，腹腔注射PMSG，目的是模仿内源性促卵泡素的作用，促进卵成熟，剂量：每只5IU（0.1 mL）。3. 注射PMSG 46-48 h后，腹腔注射HCG稀释液（方法同上），用人绒毛膜促性腺激素模仿促黄体素的诱导排卵作用，剂量：每只5IU（0.1 mL）。4. 雌鼠的性成熟度是影响超排卵数的主要因素。不同背景的小鼠超排最佳年龄也有所不同，请参照下表:![]()
1. 卵母细胞采集的时间通常在小鼠注射hCG后13-16小时内进行。2. 打开超净工作台，准备手术剪、医用镊、眼科直镊、眼科剪等（预先经过提前高压灭菌处理或者用75%的酒精浸泡），紫外灯消毒15 min。3. 打开体视显微镜，准备卵母细胞培养滴：用200 μl的移液枪取KSOM试剂，在60 mm培养皿内做若干水滴状的滴, 并用矿物油覆盖，放入培养箱（37 ℃、5%CO2）预热至少10 min。![]()
图1. 培养滴及覆盖了石蜡油的培养皿
4. 准备组织收集滴：取出35 mm培养皿，加入1 ml FHM体外操作液。5. 小鼠颈椎脱臼处死，75%酒精消毒腹部，打开腹腔取出输卵管，将其放入 FHM 组织收集滴内。6. 在体式显微镜下观察到输卵管的上部（壶腹部）有一个明显的膨大处。用镊子固定输卵管，用一根1 ml注射针纵向撕开壶腹部，用此法将其整个撕裂，卵团会游离到液体中，如果卵团不能自己释出，可以用镊子轻轻地把它们挤出来。![]()
图2. 输卵管及卵团（B镊尖处）
7. 去除卵丘细胞：取一个100 mm的培养皿盖，并在上面做8个100 µl的FHM滴，用200 μl的移液枪将卵团收集到其中一个滴内，加入同体积的透明质酸酶（HY，0.3 mg/ml）,可用移液枪轻轻吹打几下，放入CO2培养箱中，1分钟后取出，在体视显微镜下观察卵母细胞已经分散开来，用移卵管收集卵母细胞到另外一个滴里，并用剩下的6个滴逐步清洗，完成后转移到事先准备好的KSOM滴中，放回37 ℃ CO2培养箱中备用。
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图3. 卵母细胞的处理过程（C为处理好的卵母细胞）
移液器移取20 ml的0.9%氯化钠注射液于50 ml烧杯中，用200 µl移液枪将PMSG冻干粉末反复多次溶于其中，并混匀。浓度为50 IU/ml。用1ml注射器根据实验需要的量分装到1.5 ml离心管中，封口膜封口，标注好名称及配制时间，置于-20 ℃冰箱，可保存一个月。本实验室的胚胎操作技术主要来源于中科院分子细胞中心李劲松研究员实验室，美国洛克菲勒大学转基因平台及美国洛克菲勒大学Peter Mombaerts实验室。特此致谢！1. Andras, N., Marina, G., Kristina, V. and Richard, B.(2003). Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York.唐蔚, 王倩雯, 俞骞, 李周结, 赵洁, 陈国元, 吴宝金. (2022). 小鼠超数排卵和成熟卵母细胞的采集. // 实验动物胚胎操作实验手册. Bio-101: e1010943. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010943.
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